弓形蟲病分子生物學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展

劉道華，汪天平

安徽省寄生蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

弓形蟲病(toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲寄生人體導(dǎo)致的人獸共患機(jī)會(huì)性寄生蟲病，呈世界性分布。免疫機(jī)能正常者感染弓形蟲常呈自限性，無明顯臨床表現(xiàn)，多呈隱性感染狀態(tài)。AIDS患者和腫瘤患者等免疫功能低下者感染弓形蟲常導(dǎo)致嚴(yán)重后果，主要表現(xiàn)為腦炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎或精神異常等，嚴(yán)重者可引起死亡[1-2]。孕婦感染弓形蟲可通過胎盤垂直傳播，引起不良妊娠結(jié)局，或引起嬰兒先天性弓形蟲病[3-5]。

目前，弓形蟲病的診斷方法主要分為病原學(xué)方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。病原學(xué)檢測(cè)包括直接鏡檢、滋養(yǎng)體檢查及動(dòng)物組織內(nèi)包囊的檢查等。但病原學(xué)檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，且敏感性和特異性較差。免疫學(xué)方法主要檢測(cè)血清或組織液等標(biāo)本中的弓形蟲抗體，適用于流行病學(xué)調(diào)查，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性，只能作為弓形蟲病的輔助診斷。分子生物學(xué)技術(shù)的許多新方法也逐漸應(yīng)用于弓形蟲病的診斷，為弓形蟲病的診斷提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。本文旨在對(duì)分子生物學(xué)的新技術(shù)和新方法在弓形蟲病診斷中的應(yīng)用及發(fā)展前景等進(jìn)行綜述。

1 核酸分子雜交

核酸分子雜交技術(shù)是依據(jù)核酸分子的變性、復(fù)性，使來源不同的DNA(或RNA)片段，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則形成雜交雙鏈分子。核酸分子雜交具有特異性高、靈敏性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)將其應(yīng)用于弓形蟲病的診斷。

夏愛娣等[6]采用32P標(biāo)記的弓形蟲DNA探針與無腦兒、腦積水及死胎標(biāo)本的DNA進(jìn)行核酸分子雜交，成功檢測(cè)出弓形蟲陽(yáng)性標(biāo)本。陳海峰等[7]用RH株弓形蟲抗原SAG1基因編碼序列，構(gòu)建pcDNA3-SAG1重組表達(dá)質(zhì)粒，運(yùn)用核酸分子雜交方法可以檢測(cè)弓形蟲SAG1的存在。張洪花等[8]應(yīng)用生物素標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)腦囊蟲病人、癲癇患者及健康人群的弓形蟲感染狀況，發(fā)現(xiàn)核酸分子雜交技術(shù)可應(yīng)用于弓形蟲病的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查。此外，研究者通過PCR擴(kuò)增弓形蟲TGR4核酸片段，用地高辛標(biāo)記探針和待測(cè)樣本進(jìn)行核酸雜交，結(jié)果顯示，此探針不僅特異性較好，且具有較好的敏感性[9]。國(guó)外相關(guān)研究者采用同位素標(biāo)記探針的酶聯(lián)免疫滲濾試驗(yàn)檢測(cè)弓形蟲的DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核酸分子雜交技術(shù)具有較好的敏感性、特異性，還可節(jié)約時(shí)間，實(shí)現(xiàn)操作的自動(dòng)化[10]。

2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

20世紀(jì)80年代，美國(guó)PE公司成功推出了一套快速DNA擴(kuò)增系統(tǒng)，使目的DNA片段的拷貝數(shù)擴(kuò)增至百萬(wàn)倍以上，具有特異、敏感和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[11]。隨著PCR技術(shù)的深入研究和快速發(fā)展，衍生出了巢氏PCR、熒光定量PCR、原位PCR、多重PCR等相關(guān)技術(shù)，這些方法均逐漸應(yīng)用于弓形蟲病的診斷。

2.1常規(guī)PCR PCR利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，經(jīng)高溫變性、低溫復(fù)性、子鏈延伸的不斷循環(huán)，在體外快速、選擇性地?cái)U(kuò)增目的基因。 謝德華等[12]以弓形蟲核糖體DNA第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)序列作為遺傳標(biāo)記，利用上游引物：5'-GATTTGCATTCAAGAAGCGTGATAGTAT-3'，下游引物：5'-AGTTTAGGAAGCAATCTGAAAGCACATC-3'，構(gòu)建了PCR診斷方法。該方法可檢測(cè)出10個(gè)弓形蟲速殖子DNA，且與其他8種原蟲和線蟲均無交叉反應(yīng)，證實(shí)該方法具有較高的靈敏性和特異性。此外，有關(guān)學(xué)者以弓形蟲高度重復(fù)基因序列 529 bp建立了PCR診斷方法，最低可檢測(cè)出10個(gè)拷貝的弓形蟲DNA片段[13]。

PCR技術(shù)建立起來后，迅速應(yīng)用到臨床試驗(yàn)。研究者采用PCR技術(shù)對(duì)生殖道、分泌物、孕婦和3個(gè)月以下嬰兒全血進(jìn)行弓形蟲感染的檢測(cè)，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行了比較分析，證實(shí)了PCR技術(shù)檢測(cè)弓形蟲感染具有較高的可靠性[14-15]。

2.2巢式PCR 巢式PCR是對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)的完善、改進(jìn)及發(fā)展，應(yīng)用兩對(duì)引物擴(kuò)增DNA片段。Fuentes等[16]首次采用根據(jù)弓形蟲B1基因建立了巢氏PCR，所用上游引物：5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3'，下游引物：5'-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3'，并用該方法檢測(cè)尿液中弓形蟲DNA，進(jìn)行嬰兒先天性弓形蟲病的產(chǎn)前診斷。另外，國(guó)外有學(xué)者根據(jù)弓形蟲B1基因構(gòu)建了巢式PCR，并證實(shí)該方法可確診弓形蟲性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎[17]。張瑩光等[18]根據(jù)弓形蟲529 bp重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，建立巢式PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)出0.1 pg的弓形蟲DNA，其最低檢測(cè)限比常規(guī)PCR提高了100倍，且該方法對(duì)蜥蜴利什曼原蟲、隱孢子蟲、細(xì)粒棘球絳蟲基因組擴(kuò)增無條帶，特異性強(qiáng)。程寧等[19]采用巢式PCR對(duì)早產(chǎn)兒和正常新生兒進(jìn)行弓形蟲DNA的篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒弓形蟲感染率較高，提示弓形蟲感染可能是引起早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素之一。

隨著巢式PCR的發(fā)展，又出現(xiàn)了半巢式PCR技術(shù)。半巢式PCR應(yīng)用3條引物而進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。王素華[20]利用弓形蟲RH株的P30基因設(shè)計(jì)了3條特異性引物P1、P2及P3，成功構(gòu)建半巢氏PCR 檢測(cè)技術(shù)，并證實(shí)該方法靈敏性高，可檢測(cè)18 fg的弓形蟲DNA?？椎孟璧萚21]同樣利用弓形蟲的P30基因?yàn)樽鳛檠芯繉?duì)象，建立了半巢式PCR檢測(cè)體系，證實(shí)了最低可檢測(cè)18 fg的弓形蟲DNA，極大地提高了檢出率，為弓形蟲早期診斷奠定基礎(chǔ)。

2.3熒光定量PCR 熒光定量PCR，又稱為實(shí)時(shí)定量PCR，將探針技術(shù)與PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合，通過測(cè)定PCR產(chǎn)物中的DNA含量來定量分析待檢樣本中目的DNA或者mRNA的含量。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者根據(jù)GenBank中弓形蟲529 bp重復(fù)序列、GRA7基因、B1基因及GRA6基因分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物，成功構(gòu)建了弓形蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法[22-23]。研究者還利用構(gòu)建的熒光定量PCR方法，對(duì)無償獻(xiàn)血者進(jìn)行弓形蟲感染的篩查，對(duì)病死豬及組織樣品進(jìn)行弓形蟲感染情況的檢測(cè)，并與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR法的檢出率顯著高于常規(guī)PCR法[24]。此外，采用特定熒光定量PCR引物對(duì)新孢子蟲、牛巴貝斯蟲等寄生蟲DNA的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，顯示出較好的特異性[25]。因此，熒光定量PCR比常規(guī)PCR技術(shù)更加快捷、敏感、準(zhǔn)確，適合臨床實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)標(biāo)本弓形蟲感染的檢測(cè)。

2.4原位PCR 1990年，Hasse等人將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合在一起，成功建立了原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，簡(jiǎn)稱原位PCR[26]。原位PCR將原位雜交的定位性與PCR的高度敏感性結(jié)合，極大地提高了原位雜交對(duì)低復(fù)制樣品檢測(cè)的敏感性，克服了PCR技術(shù)因擴(kuò)增產(chǎn)物無法在細(xì)胞組織中定位而不能與形態(tài)學(xué)特征結(jié)合的不足。

李爽等[27]以弓形蟲RH株的速殖子感染小鼠，取肝臟制備了石蠟標(biāo)本及冰凍切片標(biāo)本，采用直接原位PCR擴(kuò)增并檢測(cè)石蠟標(biāo)本中的弓形蟲DNA，結(jié)果弓形蟲病原體檢出率為100%，顯著優(yōu)于免疫組化法。盧慎[28]應(yīng)用間接原位PCR技術(shù)，檢測(cè)3所醫(yī)院共86例病理診斷為慢性非特異性淋巴結(jié)炎患者石蠟包埋切片組織中的弓形蟲DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47例弓形蟲陽(yáng)性，占54.65%。此外，他還采用免疫組化、原位雜交及間接原位PCR技術(shù)三種方法，檢測(cè)71例診斷為慢性非特異性淋巴結(jié)炎(淋巴結(jié)反應(yīng)性增生)患者組織切片中的弓形蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間接原位PCR的檢出率明顯高于免疫組化和原位雜交法[29]。

2.5多重PCR 多重PCR(MPCR)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR技術(shù)，是1988年Chamberlian等首次提出的[30]。多重PCR的主要優(yōu)勢(shì)是在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上引物，分別擴(kuò)增不同的模板，可同時(shí)得到不同的目的片段。因此，多重PCR技術(shù)不但保留了常規(guī)PCR方法的特異性及敏感性，而且減少了操作步驟和試劑用量，提高了檢測(cè)效率，節(jié)約了檢測(cè)成本。

趙錦等[31]成功構(gòu)建了可同時(shí)檢測(cè)弓形蟲和乙肝DNA的多重PCR，以乙肝病人血液及弓形蟲RH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹水為樣本，通過基因片段篩選，進(jìn)行弓形蟲和乙肝病毒基因片段的擴(kuò)增，證明該方法能夠有效診斷弓形蟲感染，可用于弓形蟲感染的實(shí)驗(yàn)室篩查。彭武麗等[32]以牛新孢子蟲Nc-5基因和弓形蟲GRA6基因作為目的基因，各設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，建立了可同時(shí)檢測(cè)牛新孢子蟲和弓形蟲的雙重PCR方法，并用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行篩檢，證明此方法具有較好的特異性和重復(fù)性。于新友等[33]依據(jù)GenBank中豬弓形蟲和附紅細(xì)胞體核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，優(yōu)化雙重PCR反應(yīng)條件，成功構(gòu)建了雙重PCR檢測(cè)體系，此方法可同時(shí)進(jìn)行這兩種病原的檢測(cè)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

2000年，日本學(xué)者Notomi等人研發(fā)了一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、特異且低成本的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，即LAMP技術(shù)[34]。LAMP技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、操作步驟簡(jiǎn)單、靈敏性極高、特異度好、結(jié)果判定簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。LAMP技術(shù)一經(jīng)問世，迅速應(yīng)用于寄生蟲病領(lǐng)域，并取得良好效果。

近年來，研究者根據(jù)弓形蟲SAG1基因、529 bp高度重復(fù)序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，不斷優(yōu)化反應(yīng)步驟和實(shí)驗(yàn)條件，成功構(gòu)建了LAMP法。在建立LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)人血清和人工接種動(dòng)物肌肉組織弓形蟲感染情況進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)PCR法、ELISA法進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP法的最低檢測(cè)限比傳統(tǒng)PCR提高了100倍，且與其他人體常見寄生蟲及原蟲無任何交叉反應(yīng)現(xiàn)象，還可彌補(bǔ)ELISA 法僅檢測(cè)弓形蟲抗體而無法確診的不足[35-36]。此外，LAMP法也被應(yīng)用到豬弓形蟲病的診斷。在建立豬弓形蟲病LAMP檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)豬血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP法具有極高的敏感性，且與常見病原體沒有交叉反應(yīng)，能夠作為判斷家畜是否感染弓形蟲的分子檢測(cè)手段[37-38]。

4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)又稱DNA芯片技術(shù)，是將大量的探針分子固定于支持物后與待檢樣本雜交，依據(jù)檢測(cè)探針上的雜交信號(hào)而獲取待檢樣本的相關(guān)信息?；蛐酒哂懈咄?、微型化、多樣化和自動(dòng)化等諸多優(yōu)勢(shì)。近年來，基因芯片技術(shù)飛速發(fā)展，并逐漸應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，在疾病的診斷、藥物靶點(diǎn)的篩選和致病基因的測(cè)序等方面得到了廣泛應(yīng)用，發(fā)展前景十分廣闊[39-42]。

易廣才[43]依據(jù)Genbank 中弓形蟲(TOX)、風(fēng)疹病毒(RV)、巨細(xì)胞病毒(HCMV169)、單純皰疹病毒(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ)基因序列分別設(shè)計(jì)16只寡核苷酸探針，成功構(gòu)建基因芯片技術(shù)，證明該基因芯片可同時(shí)檢測(cè)5種致病微生物，并與熒光定量PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果基本一致。此外，研究者根據(jù)弓形蟲基因和常見人獸共患病原基因作為目的基因，設(shè)計(jì)合成特異性引物及適宜探針，成功構(gòu)建了液相基因芯片檢測(cè)方法，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該方法檢測(cè)弓形蟲感染具有較好的敏感性和特異性[44-45]。

5 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)是鑒定目的基因最準(zhǔn)確的方法，最早建立的DNA測(cè)序方法有兩種，即Sanger雙脫氧末端終止法和化學(xué)降解法[46]。人類基因組計(jì)劃的實(shí)施推動(dòng)了基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在第一代基因測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，已經(jīng)發(fā)展到第二代測(cè)序技術(shù)、第三代單分子測(cè)序技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)。

郭玲玲等[47]提取弓形蟲RH株速殖子總RNA，根據(jù)棒狀體蛋白18基因(TgROP18)的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增ROP18基因，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，TgROP18蛋白具有良好的免疫原性，為弓形蟲疫苗的研究提供基礎(chǔ)資料。劉楠等[48]提取弓形蟲總RNA，根據(jù)TgROP16基因的開放閱讀框架設(shè)計(jì)引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增ROP16基因，經(jīng)基因測(cè)序及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TgROP16蛋白具有良好的抗原性及免疫原性，有望作為弓形蟲疫苗候選分子。章瑩等[49]成功提取了弓形蟲RH株的cDNA和基因組DNA，經(jīng)酶切反應(yīng)、PCR擴(kuò)增及基因序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的重組蛋白，該重組蛋白具有較好的生物學(xué)活性，可能成為弓形蟲特異性藥物靶標(biāo)之一。

6 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，核酸分子雜交技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，且可對(duì)DNA或RNA進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。PCR技術(shù)及衍生的諸多新分子生物學(xué)技術(shù)，不僅提高了弓形蟲病檢測(cè)的敏感性和特異性，而且為弓形蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)篩查提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。LAMP法在檢測(cè)弓形蟲感染方面具有快速簡(jiǎn)便、敏感性高、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景良好?；蛐酒夹g(shù)和基因測(cè)序技術(shù)逐漸應(yīng)用于弓形蟲病的診斷、藥物靶點(diǎn)的篩選等方面，其發(fā)展前景令人期待。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展和不斷完善，其作為一種可彌補(bǔ)病原學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)不足的新方法，必將給弓形蟲病的診斷提供更強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。