互花米草入侵對天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成及多樣性的影響

霍玉珠，王銀華，王春萍，王麗霞，馬成倉，郭宏宇

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

互花米草（Spartina alterniflora）原產于北美大西洋沿岸，1979 年互花米草被引入我國用于沿海地區(qū)的海岸線防護[1].引種成功后互花米草在我國沿海地區(qū)迅速擴張，目前互花米草入侵面積已達約50 000 hm2[2]，已成為沿海濕地中最主要的入侵植物之一，對我國沿海濕地生態(tài)系統(tǒng)產生了多方面的影響[3].研究表明，互花米草入侵可改變濕地土壤理化性質[4]、濕地植物群落組成[5]及濕地生態(tài)系統(tǒng)中的物質循環(huán)過程[6-7].

濕地土壤微生物是濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在推動物質循環(huán)、能量流動、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用[8].研究表明，互花米草入侵會對濕地土壤理化性質和土壤微生物群落產生顯著影響.如鄭潔等[9]在福建閩江河口濕地的研究發(fā)現(xiàn)，互花米草入侵使紅樹林土壤質量發(fā)生明顯退化，土壤微生物群落多樣性指數(shù)明顯下降；Cui 等[10]在江蘇鹽城沿海濕地的研究發(fā)現(xiàn)，互花米草入侵使硫酸鹽還原菌（SRB）群落的豐富度和多樣性顯著提高；Liu 等[11]在九江紅樹林濕地的研究表明，互花米草入侵改變了土壤細菌群落組成和功能；Yang 等[12]在江蘇鹽城濕地自然保護區(qū)的研究顯示，互花米草入侵使土壤真菌功能類群發(fā)生了改變，其中腐生真菌的相對豐度顯著增加，共生真菌和病原性真菌的相對豐度顯著降低.

天津濱海濕地位于渤海灣西岸，在維持生物多樣性、調蓄洪水、降解污染物、調節(jié)氣候等方面發(fā)揮著重要的生態(tài)功能[13].近年來，天津濱海濕地中互花米草入侵日益加劇[14]，而目前關于天津濱海濕地中互花米草入侵對土壤微生物群落組成和多樣性影響的研究尚未見報道.本研究通過對比分析不同程度互花米草入侵條件下天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成及多樣性的差異，探究互花米草入侵對天津濱海濕地土壤微生物群落的影響.研究結果將為更好地保護和合理利用天津濱海濕地土壤微生物資源，有效發(fā)揮其在天津濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中的作用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019 年4 月份，在天津濱海濕地有入侵互花米草群落的同一區(qū)域內（38°39′N，117°34′E），選擇互花米草入侵程度不同的3 個樣地：尚未入侵樣地（NI），主要植被為蘆葦（Phragmites australis）；中等入侵樣地（MI），互花米草和蘆葦相對蓋度均約為50%；完全入侵樣地（CI），主要植被為互花米草.在每個樣地中隨機選定5 個重復樣方，在每個樣方中用五點采樣法采集0～20 cm 土壤樣品，充分混勻后放入無菌樣品袋密封并標記，帶回實驗室-20 ℃保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤理化性質分析

土壤含水量（SWC）采用烘干稱重法測定，土壤pH值采用酸度計法測定（土水質量比為1 ∶1）；土壤有機質含量（SOM）采用燃燒法測定；土壤鹽度（S）采用重浸法測定，土壤總氮（TN）和硝態(tài)氮（NO3--N）含量采用紫外分光光度法測定；土壤亞硝態(tài)氮（NO2--N）含量采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定；土壤銨態(tài)氮含量（NH4+-N）采用靛酚藍比色法測定；土壤有效磷（AP）含量采用鉬酸銨分光光度法測定.

1.2.2 土壤細菌和真菌的分離與鑒定

采用經典稀釋涂布平板法對土壤樣品中可培養(yǎng)細菌與真菌的群落組成進行分析.先進行預實驗確定土壤稀釋倍數(shù)，使平板上菌落數(shù)量約為30～300 個.對稀釋后的菌液進行涂布.采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對細菌進行培養(yǎng)，37 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d；采用孟加拉紅培養(yǎng)基對真菌進行培養(yǎng)，28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d.利用菌落計數(shù)器對不同形態(tài)的菌落進行計數(shù)，用劃線法將其純化為單一形態(tài)的菌落. 利用細菌和真菌基因組DNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）分別提取細菌和真菌基因組DNA，并以其為模板對特定片段進行PCR 擴增. 利用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴增細菌16S rRNA 基因片段，利用引物Geo A2（5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和Geo11（5′-ACCTTGTTACTTTTACTTCC-3′）擴增真菌18S rRNA 基因片段.擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，應用BLAST 程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對測序結果進行比對分析.

1.3 數(shù)據處理

根據各樣方中的細菌和真菌群落組成數(shù)據，分別計算細菌和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H）和Simpson 多樣性指數(shù)（D），計算公式如下：

式中：Pi表示群落中第i 個物種的個體數(shù)占群落中個體總數(shù)的比例.

應用SPSS19.0 軟件對數(shù)據進行單因素方差分析，并進行Tukey HSD 多重比較分析，應用SigmaPlot13.0軟件作圖.應用PAST 3 軟件對土壤微生物群落組成特征進行非度量多維尺度分析（NMDS）.應用Canoco 5軟件對土壤微生物群落組成和土壤理化因子間的相關關系進行冗余分析（RDA）.

2 結果與分析

2.1 互花米草入侵程度對天津濱海濕地土壤理化性質的影響

不同的互花米草入侵程度下，天津濱海濕地土壤理化性質的差異如表1 所示.由表1 可以看出，不同樣地間土壤含水量、土壤鹽度和土壤有機質含量無顯著差異，表明互花米草入侵對天津濱海濕地的這3個土壤因子尚未有顯著影響（P ＞0.05）；不同樣地間土壤pH 值有顯著差異，且呈現(xiàn)出隨互花米草入侵程度的增加土壤pH 值逐漸降低的趨勢（P ＜0.05）；土壤總氮含量、硝態(tài)氮含量、亞硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和有效磷含量均隨互花米草入侵程度的增加呈先升高再降低的變化趨勢（P ＜0.01）.

表1 不同互花米草入侵程度條件下天津濱海濕地土壤的主要理化性質Tab.1 Soil properties in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.2 互花米草入侵程度對天津濱海濕地土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌數(shù)量的影響

在不同的互花米草入侵程度下，天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量如圖1 所示.由圖1 可以看出，互花米草入侵對土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量影響顯著（P ＜0.05），隨著互花米草入侵程度的增加，土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量均呈先增加后下降的趨勢，且在互花米草完全入侵樣地（CI）中土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量均顯著低于尚未入侵樣地（NI）和中等入侵樣地（MI）（P ＜0.05）.

圖1 天津濱海濕地不同互花米草入侵程度條件下土壤可培養(yǎng)細菌和真菌數(shù)量Fig.1 Quantities of culturable soil bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.3 互花米草入侵程度對天津濱海濕地土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成的影響

本研究在天津濱海濕地土壤中分離得到可培養(yǎng)細菌和真菌各12 個屬.分析結果表明，互花米草入侵對天津濱海濕地土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌的群落組成有顯著影響.如圖2（a）所示，尚未入侵樣地中土壤可培養(yǎng)細菌有9 個屬，中等入侵樣地中土壤可培養(yǎng)細菌有10 個屬，完全入侵樣地中土壤可培養(yǎng)細菌有6個屬.不同樣地土壤中均含有芽孢桿菌屬（Bacillus）、放線菌屬（Actinomyces）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和考克氏菌屬（Kocuria），其中芽孢桿菌屬在各個樣地中都占有較高的比例.紅球菌屬（Rhodococcus）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和溶桿菌屬（Lysobacter）出現(xiàn)在尚未入侵樣地和中等入侵樣地土壤中，諾卡氏菌屬（Nocardia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）僅出現(xiàn)在中等入侵樣地土壤中，葡萄球菌屬（Staphylococcus）僅出現(xiàn)在尚未入侵樣地土壤中，類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）出現(xiàn)在中等入侵樣地和完全入侵樣地土壤中.

圖2 天津濱海濕地不同互花米草入侵程度條件下土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成Fig.2 Community composition of soil culturable bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

如圖2（b）所示，尚未入侵樣地土壤可培養(yǎng)真菌有7 個屬，中等入侵樣地中土壤可培養(yǎng)真菌有9 個屬，而完全入侵樣地土壤可培養(yǎng)真菌有6 個屬.不同樣地土壤中均含有曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）和青霉屬（Penicillium）.鐮刀菌屬（Fusarium）和鏈格孢屬（Alternaria）出現(xiàn)在尚未入侵樣地和中等入侵樣地土壤中，根霉屬（Rhizopus）和短梗霉屬（Aureobasidiu）僅出現(xiàn)在尚未入侵樣地土壤中，毛霉屬（Mucor）和綠僵菌屬（Metarhizium）出現(xiàn)在中等入侵樣地和完全入侵樣地土壤中，彎孢霉屬（Fusarium）僅出現(xiàn)在完全入侵樣地土壤中，瑪麗亞霉屬（Mariannaea）和單格孢屬（Monodictys）僅出現(xiàn)在中等入侵樣地土壤中.

對不同樣地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成進行NMDS 分析，結果如圖3 所示.

由圖3 可以看出，細菌群落和真菌群落分別按照不同樣地有明顯的聚集趨勢，表明不同互花米草入侵程度對天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成有顯著的影響.

圖3 天津濱海濕地不同互花米草入侵程度條件下土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成的非度量多維尺度分析（NMDS）（基于Bray-Curtis 相異系數(shù)）Fig.3 NMDS analysis of the community composition of culturable soil bacteria and fungi（Based on Bray-Curtis dissimilarity index）in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.4 互花米草入侵程度對天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落多樣性的影響

圖4 不同互花米草入侵程度條件下天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的群落多樣性Fig.4 Community diversity indexes of culturable bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland soil under different S.alterniflora invasion extents

不同互花米草入侵程度下，天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌群落和真菌群落的多樣性特征如圖4 所示.由圖4 可以看出，互花米草入侵對天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌群落和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)和Simpson 多樣性指數(shù)均有顯著影響（P ＜0.05）.隨著互花米草入侵程度的增加，細菌群落和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)和Simpson 多樣性指數(shù)均呈先升高再降低的趨勢，互花米草完全入侵樣地的多樣性指數(shù)顯著低于尚未入侵樣地和中等入侵樣地的數(shù)值（P ＜0.05）.

2.5 土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間的相關關系

不同互花米草入侵程度條件下，天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間的冗余分析（RDA）結果如圖5 所示，各土壤因子對微生物群落組成變異的解釋度如表2 所示.由圖5（a）可以看出，前2 個RDA 軸的特征值分別為0.622 8 和0.221 9，對細菌群落組成變異的解釋度為84.47%.由表2 可知，對土壤可培養(yǎng)細菌群落組成起主導作用的土壤因子為銨態(tài)氮含量（解釋度為45.80%，P ＜0.01）和亞硝態(tài)氮含量（解釋度為27.60%，P ＜0.01）.類芽孢桿菌屬與土壤有機質含量和鹽度呈正相關關系，與土壤pH 值呈負相關關系；紅球菌屬、諾卡氏菌屬、節(jié)桿菌屬、溶桿菌屬、考克氏菌屬和假單胞菌屬與土壤亞硝態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量、總氮含量、銨態(tài)氮含量和有效磷含量均呈正相關關系.

由圖5（b）可以看出，前2 個RDA 軸的特征值分別為0.551 4 和0.368 6，對真菌群落組成變異的解釋度為91.00%.由表2 可知，對土壤可培養(yǎng)真菌群落組成起主導作用的土壤因子為銨態(tài)氮含量（解釋度為53.30%，P ＜0.01）、亞硝態(tài)氮含量（解釋度為18.70%，P ＜0.01）、有效磷含量（解釋度為10.10%，P ＜0.05）. 曲霉屬、單格孢屬和瑪麗亞霉屬與土壤有效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和總氮含量均呈正相關關系；毛霉屬、綠僵菌屬和木霉屬與土壤亞硝態(tài)氮含量呈正相關關系；鏈格孢屬、鐮刀菌屬、根霉屬、青霉屬和短梗霉屬與土壤pH 值呈正相關關系；彎孢霉屬與土壤鹽度呈正相關關系.

圖5 不同互花米草入侵程度條件下天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成與土壤理化性質間相關關系的冗余分析Fig.5 RDA between the composition of culturable bacterial and fungal communities and the physical and chemical properties of soil in Tianjin coastal wetland soil under different S.alterniflora invasion extents

表2 冗余分析中各土壤因子對微生物群落組成變異的解釋度Tab.2 Explaining percentage of soil factors in RDA

3 討論

本研究在天津濱海濕地3 個互花米草入侵程度不同的樣地中采集土樣，分析互花米草入侵對濱海濕地土壤微生物群落的影響.研究發(fā)現(xiàn)，一定程度的互花米草入侵使天津濱海濕地土壤pH 值有所降低，這可能與互花米草凋落物和根系分泌物中含有酸性物質有關[15]，其他研究中也發(fā)現(xiàn)互花米草入侵能夠使?jié)竦氐耐寥纏H 值降低[12，16].中等程度的互花米草入侵能夠使?jié)竦赝寥赖目偟?、硝態(tài)氮含量、亞硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和有效磷含量顯著增加，這可能是由于互花米草入侵在一定程度上改變了濕地土壤中物質循環(huán)的模式[17-19]，已有研究表明互花米草根系的共生固氮菌和從枝真菌有較強的固氮作用[14，20]，且互花米草較蘆葦有著更高的根系歸還量及更高的凋落物分解速率[21]，從而一定程度的互花米草入侵使土壤中有效氮和有效磷含量顯著增加.而互花米草完全入侵樣地中有效氮和磷的含量出現(xiàn)下降，可能是因為互花米草群落有較高的生長速率[1]，從而吸收利用了土壤中大量的有效氮和磷.此外，有研究表明互花米草的入侵可顯著促進土壤的反硝化作用和N2O 的排放，這可能也是互花米草完全入侵樣地中土壤氮含量降低的原因[22-23].

中等程度的互花米草入侵使天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量顯著增加，這可能是由于一定程度的互花米草入侵顯著提高了土壤有效氮和磷的含量，從而可以供給更多數(shù)量的微生物生長[24]，有研究指出一定程度的氮輸入增加可緩和濕地土壤中氮素含量的限制，從而促進微生物總量的增加[25].在互花米草完全入侵樣地中土壤可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量顯著降低，這可能是由于互花米草群落的快速生長吸收利用了土壤中大量的有效氮和磷等營養(yǎng)物質，從而使土壤微生物數(shù)量降低[26].這樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他濕地生態(tài)系統(tǒng)中，如Yang 等[27-28]在江蘇鹽城濱海濕地的研究表明，隨著互花米草入侵時間和程度的增加，當?shù)貪竦赝寥乐屑毦驼婢臄?shù)量均顯著降低.

本研究結果表明，互花米草入侵對天津濱海濕地土壤的可培養(yǎng)細菌和真菌群落組成及其多樣性有顯著影響，總體上多樣性指數(shù)隨互花米草入侵程度的增加呈先升高再降低的趨勢.這可能是由于中等程度互花米草入侵條件下，天津濱海濕地土壤有效氮和磷等營養(yǎng)物質含量較高，從而有利于更多種類微生物的生存[29]；而在互花米草完全入侵條件下，土壤中大量有效營養(yǎng)物質被互花米草群落吸收利用，導致土壤微生物種類和多樣性降低[30].此外，本研究顯示互花米草完全入侵條件下土壤中可分泌抗生素的微生物數(shù)量有所增加，如木霉屬和青霉屬，可能會抑制對抗生素敏感的微生物類群，這也可能是該條件下土壤微生物多樣性降低的原因之一.

本研究發(fā)現(xiàn)，不同互花米草入侵程度樣地中土壤細菌群落構成主要受土壤銨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的影響，而土壤真菌群落組成主要受土壤銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和有效磷含量的影響.已有研究表明，銨態(tài)氮是細菌和真菌的主要氮源之一，會顯著影響土壤細菌和真菌群落組成[31-33]；而磷元素也是土壤養(yǎng)分循環(huán)和調控土壤微生物群落構成的重要限制性因子[34-35]，本研究結果與這些研究一致.本研究進一步表明，土壤亞硝態(tài)氮含量也是不可忽視的影響濕地土壤微生物群落構成的重要因子之一.

綜上所述，互花米草入侵將改變天津濱海濕地土壤的理化性質，進而對濕地土壤微生物群落組成和多樣性產生顯著影響.一定程度的互花米草入侵可能會在短期內改善濕地土壤營養(yǎng)條件，有利于濕地土壤微生物的生存和生長，提高微生物多樣性.然而，隨著互花米草入侵程度的進一步增加，土壤營養(yǎng)水平反而會有所降低，這將長期對天津濱海濕地土壤微生物群落組成和多樣性產生不利影響.