印第安納沙門(mén)菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立

龔建森，徐敬瀟，付立霞，張 笛，董永毅，徐 步，竇新紅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3.江蘇省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南京 210036)

沙門(mén)菌是重要的人畜共患病原菌，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失與食品安全問(wèn)題。沙門(mén)菌血清型繁多，其中，廣受關(guān)注的是臨床分離率高的血清型，如腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌[1]。但在特定地區(qū)或年代，某些原本罕見(jiàn)的血清型也可發(fā)展成流行血清型[2]。印第安納沙門(mén)菌(S.Indiana)早期報(bào)道罕見(jiàn)，但近年來(lái)在國(guó)內(nèi)報(bào)道頻率呈顯著上升趨勢(shì)，在養(yǎng)殖、食品和環(huán)境中具有較高流行率，引起畜禽養(yǎng)殖、食品安全、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的高度關(guān)注[3-5]。

目前，對(duì)S.Indiana的檢測(cè)均基于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，過(guò)程繁瑣費(fèi)時(shí)，不能滿(mǎn)足及時(shí)發(fā)現(xiàn)病原、控制傳播途經(jīng)，消除污染源的疫病防控要求。此外對(duì)S.Indiana血清學(xué)檢測(cè)需鑒定O抗原和H抗原，對(duì)于 “自凝菌株”或“鞭毛發(fā)育不良菌株”等不能進(jìn)行有效檢測(cè)，造成假陰性結(jié)果[6]。隨著科技發(fā)展，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的病原檢測(cè)方法在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展，以其敏感特異、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)成為最具潛力的檢測(cè)方法。目前，已成功報(bào)道的分子生物學(xué)檢測(cè)方法涉及腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等多個(gè)血清型[7]。S.Indiana因其廣泛流行與高度耐藥的特性已受到多個(gè)研究領(lǐng)域的高度關(guān)注，特別是S.Indiana已普遍對(duì)WHO推薦治療系統(tǒng)性沙門(mén)菌感染[9]的環(huán)丙沙星和頭孢曲松產(chǎn)生耐藥。鑒于此，有必要建立一種快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便的方法用于臨床樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

39株參考菌株(31株沙門(mén)菌，8株非沙門(mén)菌)和359株分離株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存并提供。Bst酶購(gòu)自NEB公司；PrimeStarHS高保真酶、rTaq酶、pMD19、BstB Ⅰ、BamHⅠ購(gòu)自TaKaRa公司；鈣黃綠素購(gòu)自Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)靶點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì) 通過(guò)BLAST程序?qū)⒁压嫉腟.Indiana C629株全基因組序列(NZ_CP015724.1)中4 739個(gè)基因與其他已知基因進(jìn)行比對(duì)，利用比較基因組學(xué)方法篩選特異基因。通過(guò)在線軟件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物組。

1.2.2 反應(yīng)體系建立 以S.Indiana ATCC51959基因組為模板進(jìn)行體系優(yōu)化。采用25 μL反應(yīng)體系，分別對(duì)Bst酶、Mg2+、dNTPs、內(nèi)引物、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1.2.3 反應(yīng)產(chǎn)物鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物使用BstB I消化，在20 μL體系中加入5 μL 的LAMP產(chǎn)物、1 μLBstBⅠ、2 μL 10×L Buffer，37 ℃酶切3 h。同時(shí)，以BamHⅠ為對(duì)照。酶切產(chǎn)物使用2%凝膠電泳分析，產(chǎn)物回收測(cè)序后經(jīng)BLAST驗(yàn)證。

1.2.4 特異性驗(yàn)證 以39株參考菌株基因組模板，使用優(yōu)化后的LAMP體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.5 靈敏度測(cè)試 使用pMD19載體構(gòu)建含靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。測(cè)定質(zhì)粒起始濃度后，以10倍比稀釋的質(zhì)粒為模板，分別按已建立LAMP方法和常規(guī)PCR方法(使用F3和B3為引物)進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。PCR體系：12.5 μL 2×TaqDNA聚合酶預(yù)混液，5 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水適量。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物使用2%凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 可視化反應(yīng) 配制含1.25 mmol·L-1鈣黃綠素與15 mmol·L-1氯化錳熒光指示劑，反應(yīng)前，加入1 μL，反應(yīng)后，通過(guò)溶液顏色變化或熒光強(qiáng)弱判斷是否發(fā)生反應(yīng)。

1.2.7 防污染LAMP體系的建立 使用UDG與dUTP系統(tǒng)建立防污染LAMP體系[8]，即向反應(yīng)體系中加入0.35 μL的100 mmol·L-1dUTP進(jìn)行反應(yīng)。將含dUTP和普通LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至103、106、109倍，以稀釋后的產(chǎn)物為模板再進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其中，含dUTP的模板先用0.25 U的UDG于37 ℃預(yù)處理10 min，常規(guī)LAMP產(chǎn)物不做處理。

1.2.8 臨床分離菌株檢測(cè) 使用LAMP可視化判定方法檢測(cè)359株臨床分離細(xì)菌，設(shè)立陽(yáng)性與陰性對(duì)照。同時(shí)參考GB4789.4—2016標(biāo)準(zhǔn)中方法，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)靶點(diǎn)篩選

根據(jù)比較基因組學(xué)篩選結(jié)果，共鑒定出6個(gè)特異性候選基因。通過(guò)初步試驗(yàn)后，確定A7P63_09100基因?yàn)長(zhǎng)AMP檢測(cè)靶點(diǎn)，通過(guò)在線軟件設(shè)計(jì)LAMP檢測(cè)引物組(表1)。

表1 LAMP反應(yīng)引物組

2.2 反應(yīng)體系的建立

根據(jù)反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果，確定25 μL反應(yīng)體系：1 μLBst酶、3 μL dNTPs、2 μL Mg2+、5 μmol·L-1外引物各1 μL、40 μmol·L-1內(nèi)引物各0.75 μL、2 μL模板、2.5 μL 10×Buffer和11 μL ddH2O。反應(yīng)條件為64 ℃擴(kuò)增50 min，80 ℃滅活10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳可見(jiàn)LAMP反應(yīng)典型的階梯狀條帶(圖1)。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.LAMP產(chǎn)物；2.BstBⅠ酶切產(chǎn)物；3.BamHⅠ酶切產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照

2.3 酶切鑒定

酶切結(jié)果表明，該LAMP產(chǎn)物可以被BstBⅠ消化，而不能被BamHⅠ消化(圖1)。產(chǎn)物回收測(cè)序，將結(jié)果(MT329629)進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，相似性達(dá)100%。

2.4 特異性驗(yàn)證

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，僅S.Indiana ATCC51959菌株出現(xiàn)典型的階梯狀條帶，其余菌株均為陰性。

2.5 靈敏度測(cè)試

經(jīng)拷貝數(shù)計(jì)算，質(zhì)粒初始拷貝數(shù)為2.95×105拷貝·μL-1。檢測(cè)結(jié)果表明，LAMP方法可檢出5.9×101拷貝·反應(yīng)-1，而PCR方法為5.9×102拷貝·反應(yīng)-1。

2.6 可視化反應(yīng)

陽(yáng)性樣品在可見(jiàn)光下呈綠色，陰性樣品呈橘黃色；在紫外線下，陽(yáng)性管可激發(fā)明亮熒光，而陰性管未見(jiàn)熒光，表明可通過(guò)鈣黃綠素實(shí)現(xiàn)可視化判定。

2.7 防污染試驗(yàn)

使用UDG-dUTP系統(tǒng)的反應(yīng)體系未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，表明該系統(tǒng)可有效避免氣溶膠污染，而未使用UDG-dUTP系統(tǒng)的反應(yīng)體系仍檢測(cè)出稀釋109倍的產(chǎn)物。

2.8 分離菌檢測(cè)

359株分離菌(自凝株6株)使用細(xì)菌學(xué)方法共鑒定出158株沙門(mén)菌(自凝株3株)。使用LAMP方法對(duì)155株非自凝沙門(mén)菌分型，結(jié)果(表2)表明，64株為S.Indiana，與血清學(xué)結(jié)果一致。而3株沙門(mén)菌自凝株中有1株LAMP反應(yīng)陽(yáng)性，對(duì)該陽(yáng)性菌株測(cè)序結(jié)果表明其為S.Indiana。

表2 臨床分離菌檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

LAMP是一種高效核酸分子等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，已在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]。該方法不需要昂貴的反應(yīng)設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)比較基因組學(xué)成功篩選出S.Indiana特異性基因序列，并以此為靶標(biāo)建立了特異性LAMP檢測(cè)方法。試驗(yàn)表明，該方法具有較好的特異性，其檢測(cè)下限為59拷貝·反應(yīng)-1，優(yōu)于PCR方法，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)肉眼即可判斷，避免因開(kāi)蓋造成的污染問(wèn)題。同時(shí)本方法可在1 h內(nèi)完成樣品檢測(cè)，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。用建立的方法對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果不僅與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一致，還可用于自凝菌株檢測(cè)。上述結(jié)果表明，本研究建立的S.Indiana-LAMP方法具有快速簡(jiǎn)便、靈敏特異的特點(diǎn)，非常適合臨床快速檢測(cè)，為S.Indiana的科學(xué)防控提供一種檢測(cè)工具。

4 結(jié) 論

本研究建立的LAMP檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)印第安納沙門(mén)菌的快速檢測(cè)，對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果不僅與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.4—2016)檢測(cè)結(jié)果一致，還可用于自凝菌株檢測(cè)。