等溫核酸放大技術(shù)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用

李婷婷，王嫦嫦，白向茹，王利華，夏 定，戰(zhàn)藝芳，姚 琪，鄭思潔

武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與安全研究所，湖北 武漢 430065

重金屬通常是指密度大于4.5 g/cm3的金屬［1］，其中一些重金屬例如鐵、鋅、銅、鈷、錳等在生命系統(tǒng)中起著重要作用，是人體生命系統(tǒng)所必需的微量元素，但是過量的重金屬也會(huì)對(duì)人體造成危害。更重要的是，像汞、鉛、鉻、砷等重金屬，即使是微量也會(huì)對(duì)人體以及環(huán)境造成嚴(yán)重危害，這些重金屬對(duì)水和土壤污染難以被消解，隨著時(shí)間的推移，它們會(huì)通過食物鏈在人類和動(dòng)物體內(nèi)過度積累，導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病而危害生命［2］。因此，重金屬的檢測(cè)就顯得十分重要。

傳統(tǒng)的重金屬的檢測(cè)方法主要有色譜學(xué)、光譜學(xué)和電化學(xué)方法等［3］。而為了更及時(shí)、準(zhǔn)確地對(duì)環(huán)境中的重金屬進(jìn)行檢測(cè)，往往會(huì)涉及到一些痕量金屬元素的分析，此時(shí)也對(duì)分析技術(shù)的靈敏性與準(zhǔn)確性有了更高的要求，放大檢測(cè)技術(shù)則常被應(yīng)用來提高分析檢測(cè)的靈敏度。核酸放大技術(shù)作為一種信號(hào)放大技術(shù)一直在分析檢測(cè)中有著廣泛且重要的作用。核酸信號(hào)放大技術(shù)是基于核酸自身所具有的擴(kuò)增能力而開發(fā)的一種信號(hào)放大技術(shù)，通過一定的策略，使得一個(gè)靶標(biāo)循環(huán)誘導(dǎo)探針產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，提升了靈敏度。目前信號(hào)方法技術(shù)可分為等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)兩大類，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction，HCR）、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)（strand displacement amplification，SDA）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）、催化發(fā)夾組裝技術(shù)（catalytic hairpin assembly，CHA）等。熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction，LCR）和 核 酸 序 列 擴(kuò) 增（nucleic acid sequence amplification，NASA）等［4］。

由于核酸信號(hào)方法技術(shù)的簡便性和可操作性，已成為目前生化分析等領(lǐng)域中越來越重要的研究內(nèi)容，同時(shí)，由于核酸具有的在特定物種識(shí)別方面的能力［5］使其在食品檢測(cè)［6-8］、臨床［9-11］、環(huán)境監(jiān)測(cè)［12-14］等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA［15-16］、RNA［17］、蛋白質(zhì)［18-19］等超低濃度的檢測(cè)，具有高靈敏度和選擇性。而當(dāng)前，由于一些功能核酸的發(fā)現(xiàn)，如可以與汞離子特異性識(shí)別 的 富T 序 列［20］、鉛 離 子 依 賴 的“8-17”DNAzyme［21-22］等更使得核酸放大技術(shù)被廣泛的應(yīng)用與重金屬檢測(cè)的方法構(gòu)建中。本文則主要介紹等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用，通過分析不同類別的等溫核酸放大技術(shù)在重金屬檢測(cè)的設(shè)計(jì)原理及思路，探討等溫核酸放大技術(shù)在重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

1 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種由Dirks 和Pierce 在2004 年首次提出的無酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［23］。該反應(yīng)設(shè)計(jì)了兩種部分互補(bǔ)的發(fā)卡DNA 探針H1 和H2，在無引物鏈的存在下，這兩種探針可以穩(wěn)定互存，當(dāng)加入引物鏈I 之后，引物I 會(huì)與H1 部分雜交使得H1 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，H1 釋放出的另一端則可以與H2 部分雜交，將H2 的發(fā)卡結(jié)構(gòu)也打開，而打開的H2 的另一端可與H1 再一次雜交，之后可進(jìn)行不停的雜交形成具有剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大與檢測(cè)。HCR 過程無需酶的參與，在常溫下即可反應(yīng)，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。

Cai 等［24］利用Hg2+誘導(dǎo)的Mg2+特 異性DNA酶（Mg2+-DNAzyme）激活進(jìn)行靶循環(huán)和HCR 在電極上引入一層DNA 水凝膠用于檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)阻抗生物傳感器，如圖1 所示，在目標(biāo)物Hg2+的存在下，Hg2+激活Mg2+-DNAzyme，選擇性切割底物，釋放出一端單鏈DNA，從而引發(fā)HCR 反應(yīng)，并在電極表面組裝了一層DNA 交聯(lián)水凝膠，該方法對(duì)Hg2+的檢測(cè)限可達(dá)0.042 pmol/L。Hong 等［25］同樣利用電化學(xué)方法構(gòu)建了對(duì)汞離子的高靈敏檢測(cè)，通過電極上構(gòu)建T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)，觸發(fā)NEase 對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的反應(yīng)，得到HCR 引發(fā)鏈，之后與亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）標(biāo)記的發(fā)夾狀信號(hào)探針（S1和S2）反生HCR 反應(yīng)，構(gòu)建了刻痕雙螺旋共聚物，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)。

圖1 結(jié)合DNA 酶和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)Hg2+的生物傳感器Fig.1 Biosensor for Hg2+detection by DNA enzyme and hybrid chain reaction

Hao 課題組［26］利用T-Hg2+-T 堿基對(duì)的形成引發(fā)HCR 反應(yīng)，得到含有大量G-四鏈體的雙聯(lián)DNA，之后在氯化血紅素存在下，具有催化活性的氯化血紅素/G-四鏈DNA 可以催化H2O2氧化ABTS 為綠色陽離子自由基ABTS·+，從而通過比色分析實(shí)現(xiàn)汞離子的檢測(cè)，其原理如圖2 所示。Tang 等［27］同樣開發(fā)了一種比色檢測(cè)汞離子的方法，利用T-Hg2+-T 作用引發(fā)HCR 反應(yīng)構(gòu)建銀納米線，銀離子可催化形成紫紅色的高錳酸鉀，通過顏色變化達(dá)到對(duì)汞離子的檢測(cè)作用。

圖2 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的Hg2+的比色檢測(cè)方法Fig.2 Hg2+colorimetric detection method based on hybrid chain reaction

Huang 課 題 組［28］則 利 用T-Hg2+-T 作 用 引 發(fā)HCR 反應(yīng)構(gòu)建了一種用于汞離子檢測(cè)的熒光生物傳感器，并利用氧化石墨烯（graphene oxide，GO）實(shí)現(xiàn)“開關(guān)”，在無汞離子存在時(shí)，GO 會(huì)吸附DNA探針，使探針上的熒光猝滅，當(dāng)汞離子存在時(shí)，通過形成T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)引發(fā)HCR，得到的DNA 雙鏈從GO 上脫離使熒光恢復(fù)從而達(dá)到對(duì)汞離子的檢測(cè)目的。Sui 等［29］通過在磁性氧化鐵（Fe3O4）納米顆粒表面修飾一段核酸適配體，以汞離子作為目標(biāo)物，當(dāng)溶液中不存在汞離子時(shí)，該適配體可以引發(fā)HCR 反應(yīng)得到一段DNA 雙鏈，之后加入熒光指示劑SYBR Green，它可以插入DNA 雙鏈中，隨后再引入Ag@SiO2納米顆粒增強(qiáng)SG 的熒光從而達(dá)到檢測(cè)的目的。

Zhuang 等［30］基于HCR 和鉛特異性的DNA 酶構(gòu)建了一種磁控電子開關(guān)，用于鉛離子的靈敏檢測(cè)。在鉛離子存在下，DNA 酶中底物DNA 片段發(fā)生裂解，釋放出捕獲鏈與二茂鐵標(biāo)記的發(fā)夾DNA發(fā)生HCR 反應(yīng)，在磁珠上形成刻痕的雙螺旋，該產(chǎn)物在外加電位下產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，通過監(jiān)測(cè)電化學(xué)信號(hào)的變化，可以間接測(cè)定鉛離子濃度。Zhang課題組［31］也開發(fā)了一種基于磁性納米材料標(biāo)記雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)銀離子的檢測(cè)。通過在Fe3O4@Au 納米材料表面標(biāo)記一段DNA，在銀離子存在下，該DNA 可以與另外一段寡核苷酸部分雜交形成分子內(nèi)雙鏈，多余的部分可以與二茂鐵標(biāo)記的發(fā)夾DNA 發(fā)生HCR 反應(yīng)，形成帶有刻痕的雙螺旋，之后將該產(chǎn)物富集在磁性金電極上進(jìn)行電信號(hào)檢測(cè)達(dá)到對(duì)目標(biāo)物分析的目的。Gu 等［32］則在金電極上構(gòu)建HCR 反應(yīng)，產(chǎn)生巨大的電荷轉(zhuǎn)移電阻（charge transfer resistance，Rct），之后引入As3+可與HCR 產(chǎn)物特異性結(jié)合，使HCR 產(chǎn)物被釋放降低了Rct，隨后加入RecJf 核酸外切酶催化降解可進(jìn)一步提高Rct，通過Rct的變化反映As3+的濃度水平。

2 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用

鏈置換擴(kuò)增技術(shù)是由Walker 等［33］在1992 年首次提出的一種恒溫DNA 擴(kuò)增方法，主要靠核酸內(nèi)切酶和與DNA 聚合酶協(xié)作完成。該技術(shù)的原理是利用寡核酸鏈與含有核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的引物雜交，在DNA 聚合酶和dNTPs 的存在下產(chǎn)生一段具有核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈DNA，而核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別并切割位點(diǎn)從而得到一段目標(biāo)單鏈DNA，而DNA 聚合酶則可在缺口處繼續(xù)復(fù)制延伸DNA 片段，又重新產(chǎn)生一條具有酶切位點(diǎn)的DNA 雙鏈，此過程經(jīng)過循環(huán)往復(fù)便產(chǎn)生大量目標(biāo)DNA。SDA 可常溫操作，具有靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

Liu 等［34］開發(fā)了一種基于SDA 檢測(cè)汞離子的比色方法，如圖3 所示，該方法利用T-Hg2+-T 結(jié)構(gòu)構(gòu)建開關(guān)觸發(fā)SDA 反應(yīng)，反應(yīng)中無酶參與，得到的SDA 產(chǎn)物可以與金納米探針結(jié)合導(dǎo)致金納米粒子聚沉，使溶液顏色從紅色變?yōu)闊o色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的檢測(cè)，該方法用加標(biāo)回收的方法驗(yàn)證了其在實(shí)際樣品中的應(yīng)用價(jià)值。Xie 等［35］同樣利用THg2+-T 結(jié)構(gòu)觸發(fā)SDA 開關(guān)，得到的SDA 產(chǎn)物可以與金電極上標(biāo)記的含有G 四鏈體的發(fā)卡DNA 結(jié)合形成Mg2+依賴的DNA 酶，隨后在Mg2+存在下該酶發(fā)生裂解并將G-四鏈體片段留在電極表面，之后通過構(gòu)建氯高鐵血紅素/G-四鏈體重復(fù)單元作為信號(hào)輸出的介質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的檢測(cè)，該方法在水樣中加標(biāo)分析回收率為96.5%～108.0%，表明這種方法對(duì)實(shí)際樣品中Hg2+的測(cè)定的可行性。

圖3 利用鏈置換擴(kuò)增的Hg2+比色檢測(cè)方法Fig.3 Hg2+ colorimetric detection method by chain displacement amplification

Li 等［36］建立了一種基于DNA 酶的鉛離子定量方法，在Pb2+存在下，DNAzyme 切割了一個(gè)含有DNA 底物的RNA，釋放單鏈DNA 作為引物進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，將熒光染料作用于反應(yīng)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的檢測(cè)，該方法具有良好的選擇性，檢出限為200 pmol/L。Chen 等［37］建立了一種基于DNA 酶與鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的新型熒光傳感器對(duì)鉛進(jìn)行超靈敏檢測(cè)。在Pb2+存在下，特異性DNA 酶被剪切，產(chǎn)生DNA 單鏈可以連續(xù)引發(fā)兩次鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，得到的目標(biāo)鏈可以被石墨烯吸附使得修飾的熒光基團(tuán)淬滅，而與其互補(bǔ)鏈雜交后，雙鏈上的熒光團(tuán)可以恢復(fù)熒光，熒光增量則與鉛離子濃度相關(guān)，該反應(yīng)可以達(dá)到6.7 pmol/L 的檢出限，其加標(biāo)回收率為96.67%～107.36%。

3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)有線性擴(kuò)增和指數(shù)擴(kuò)增兩種形式［38-39］，它是借鑒病原體的滾環(huán)復(fù)制而提出的。該技術(shù)以環(huán)形單鏈DNA 為模板，在特殊DNA 聚合酶的作用下可產(chǎn)生與環(huán)狀DNA 模板互補(bǔ)的大量單鏈DNA，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。RCA 常用的聚合酶有BstDNA 聚合酶、phi29 聚合酶等，該反應(yīng)可在常溫下進(jìn)行，并且具有較高的穩(wěn)定性，已被廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分析檢測(cè)，該反應(yīng)在重金屬檢測(cè)方面亦有應(yīng)用。

Tang 課題組［40］利用RCA 和DNA 酶發(fā)明了一種鉛離子的電化學(xué)檢測(cè)方法，如圖4 所示，當(dāng)目標(biāo)物鉛離子存在時(shí)，它可以識(shí)別修飾在特異性磁珠上的DNA 酶使其裂解釋放催化鏈引發(fā)RCA 反應(yīng)，之后該產(chǎn)物可與鎘量子點(diǎn)修飾的單鏈DNA 雜交，通過測(cè)定雜交的鎘離子的濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的檢測(cè)，該課題組將該方法用于自來水中加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到回收率為97.3%～108.0%，表明該方法對(duì)實(shí)際水樣中Pb2+的檢測(cè)具有很大的應(yīng)用潛力。Lü等［41］研發(fā)了一種電化學(xué)測(cè)定Hg2+的高效靶轉(zhuǎn)換策略，在目標(biāo)物Hg2+存在條件下，它可以與磁珠上修飾的DNA 鏈雜交，釋放RCA 引物引發(fā)RCA 反應(yīng)，RCA 產(chǎn)物可與金電極上修飾的DNA 鏈部分雜交，之后，利用亞甲基藍(lán)作為電子介質(zhì)，通過與反應(yīng)產(chǎn)物靜電結(jié)合的相互作用，獲得顯著的檢測(cè)信號(hào)，該方法的回收率在99.0%～100.4%之間，表明該方法可用于實(shí)際樣品分析。Qian［42］課題組利用RCA研發(fā)了一種鉛離子的檢測(cè)，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，磁珠表面DNA 酶發(fā)生部分裂解釋放出單鏈DNA 可觸發(fā)RCA 反應(yīng)，形成大量的寡核苷酸重復(fù)序列，隨后，這些重復(fù)序列與葡萄糖氧化酶標(biāo)記的單鏈DNA雜交，并伴隨著pH 值的下降，通過測(cè)量pH 的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的檢測(cè)。該方法與ICP-MS 進(jìn)行了比較，有較好的一致性。

圖4 基于滾環(huán)擴(kuò)增和量子點(diǎn)標(biāo)記的Pb2+檢測(cè)方法Fig.4 Pb2+detection method based on rolling ring amplification and quantum dots tagging

4 催化發(fā)夾組裝技術(shù)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用

催化發(fā)夾組裝技術(shù)是一種無酶參與的核酸放大技術(shù)，由Pierce 課題組［43］在2008 年第一次提出。它是利用不同的編程方法發(fā)揮引發(fā)鏈的催化功能，在形成雙鏈結(jié)構(gòu)之后，引發(fā)鏈被釋放，從而進(jìn)入下一輪的催化發(fā)夾組裝，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)鏈的信號(hào)放大。CHA 反應(yīng)不需要酶的輔助，僅僅通過DNA 編碼自組裝，就能完成對(duì)目標(biāo)物的超靈敏檢測(cè)，被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)領(lǐng)域。

Zhao 等［44］研發(fā)了一種基于CHA 的電化學(xué)生物傳感方法用于Pb2+的檢測(cè)，如圖5 所示。該方法設(shè)計(jì)在目標(biāo)物Pb2+存在下，Pb2+特異性DNA 酶被Pb2+識(shí)別切割，釋放引物鏈，它可以與電極表面的發(fā)夾DNA 雜交引發(fā)CHA，之后通過引入Pt@PdNCs 和錳卟啉還原H2O2，實(shí)現(xiàn)了Pb2+生物傳感器的有效信號(hào)放大，該方法在水樣中加標(biāo)回收率為94.7%～105.0%。Jin 等［45］以催化發(fā)夾組件為信號(hào)放大元件，研制了一種用于鉛離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。在鉛離子存在的情況下，設(shè)計(jì)引發(fā)CHA 反應(yīng)，在電極上合成一端標(biāo)記有生物素的DNA 雙鏈，之后通過與負(fù)載鉑納米顆粒的生物質(zhì)多孔碳結(jié)合催化對(duì)苯二酚的氧化，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)，該方法的加標(biāo)回收率在93.5%～108.0%范圍內(nèi)。Yun［46］課題組研發(fā)了一種基于氧化石墨烯（GO）和CHA 檢測(cè)Hg2+的方法。3 個(gè)熒光標(biāo)記的發(fā)夾DNA 探針可以通過π-π 堆積緊密地吸附在GO 表面，從而抑制熒光信號(hào)，當(dāng)引入汞離子后，利用T-Hg2+-T 相互作用使發(fā)卡打開并誘導(dǎo)發(fā)夾的催化自組裝，形成的含有雙鏈DNA 的剛性DNA 從GO 表面脫落，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，該方法對(duì)Hg2+具有良好的選擇性，其加標(biāo)回收率為94.0%～103.1%，在實(shí)際樣品中有很好的應(yīng)用前景。

圖5 基于催化發(fā)夾組裝的Pb2+檢測(cè)方法Fig.5 Pb2+detection method based on catalytic hairpin assembly

5 總結(jié)與展望

本文對(duì)等溫核酸放大技術(shù)在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了闡述與分析。隨著社會(huì)快速的發(fā)展，工業(yè)廢物、生活垃圾的劇增以及農(nóng)藥和化肥的大量使用，土壤、水體等遭受到了越來越嚴(yán)重的重金屬污染。因此，研發(fā)出快速、高效的重金屬檢測(cè)方法越來越重要。核酸放大技術(shù)作為一種信號(hào)放大方法，具有靈敏度高、操作便捷、成本低、綠色無污染等特點(diǎn)，是今后環(huán)境安全檢測(cè)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前基于核酸信號(hào)放大技術(shù)進(jìn)行重金屬的檢測(cè)主要是利用功能核酸，以及結(jié)合納米材料、熒光探針等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)，并且具有很高的穩(wěn)定性和特異性，因此該方法具有很大的應(yīng)用空間。但是由于目前合成出的功能核酸的種類有限，主要包括可以特異性識(shí)別汞離子的富T 序列、可以特異性識(shí)別銀離子的富C 序列以及一些特異性脫氧核酶、適配體等等，因此，利用核酸放大技術(shù)檢測(cè)重金屬依然有一定的局限性，未來有必要開發(fā)出更多的重金屬功能核酸。另外該技術(shù)目前大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，對(duì)于實(shí)際應(yīng)用仍有一定局限性，因此開發(fā)出適合實(shí)際應(yīng)用的檢測(cè)方法仍是今后科研工作者的重點(diǎn)研究方向。