脂肪醇氧化酶基因缺失對(duì)熱帶假絲酵母生理功能的影響

張海冰，張利華，陳獻(xiàn)忠，沈 微，樊 游

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

熱帶假絲酵母是一種具有工業(yè)價(jià)值的非常規(guī)二倍體酵母，可以利用烷烴、脂肪酸等非常規(guī)物質(zhì)為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)[1-2]。目前，人們主要利用熱帶假絲酵母合成長(zhǎng)鏈二元酸并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)規(guī)?；纳a(chǎn)[3-5]。當(dāng)熱帶假絲酵母以烷烴為底物時(shí)，烷烴進(jìn)入細(xì)胞后首先在微粒體中被細(xì)胞色素P450(CYP)與NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)共同催化，進(jìn)行α-氧化，進(jìn)而生成脂肪醇；隨后，脂肪醇被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，然后在脂肪醇氧化酶(FAO)或脂肪醇脫氫酶(ADH)、脂肪醛脫氫酶(FALDH)的催化作用下依次氧化成脂肪醛、脂肪酸。極少量的一元脂肪酸被分泌到細(xì)胞外，大部分的一元脂肪酸會(huì)再次轉(zhuǎn)運(yùn)至微粒體中，在相同的酶系催化作用下進(jìn)行ω-氧化，最終生成α,ω-二羧酸[6-7]。

目前，針對(duì)ω-氧化途徑相關(guān)的酶基因已經(jīng)有了一些研究。Craft等[8]從熱帶假絲酵母中克隆并鑒定10個(gè)CYP基因，并且發(fā)現(xiàn)不同的CYP存在底物特異性，可作為改造ω-氧化途徑的潛在靶點(diǎn)。Dickinson等[9]鑒定FAO為膜結(jié)合型黃素蛋白，并且對(duì)光敏感，以十二醇為底物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)FAO催化反應(yīng)符合乒乓機(jī)制。Eirich等[10]從熱帶假絲酵母ATCC 20336克隆了4個(gè)FAO基因，分別為2個(gè)FAO1、FAO2a和FAO2b，并將其在大腸桿菌進(jìn)行外源表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FAO1只負(fù)責(zé)ω位碳原子氧化，而不能氧化β位碳原子，F(xiàn)AO2a和FAO2b的作用與FAO1相反。Cheng等[11]以熱帶假絲酵母ATCC 750為出發(fā)菌株，構(gòu)建了FAOT等位基因雙缺失的菌株，無(wú)法檢測(cè)到FAOT酶活，并且細(xì)胞代謝烷烴受到很大影響。Lu等[12]累加敲除了4個(gè)FAO基因和其他12個(gè)相關(guān)基因，成功構(gòu)建了利用肉豆蔻酸甲酯為底物發(fā)酵生產(chǎn)ω-羥基脂肪酸的菌株。王澤政等[13]從熱帶假絲酵母中鑒定脂肪醛脫氫酶基因并將其在大腸桿菌中異源表達(dá)，研究了相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)，在此基礎(chǔ)上敲除了2對(duì)CtAld基因后發(fā)現(xiàn)，突變株合成長(zhǎng)鏈二元酸的能力顯著下降。然而，F(xiàn)AO基因?qū)釒Ъ俳z酵母細(xì)胞的碳源利用、細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累等生理功能影響還未見(jiàn)研究報(bào)道。

圖1 烷烴在熱帶假絲酵母中代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of alkanes in C. tropicalis

本研究中，筆者通過(guò)對(duì)熱帶假絲酵母ATCC 20336菌株的FAO基因進(jìn)行敲除及回補(bǔ)，構(gòu)建了3株基因突變菌株和2株基因回補(bǔ)菌株，分析了不同菌株在不同碳源中的生長(zhǎng)情況及胞內(nèi)酶活變化，并將突變菌株以烷烴為底物進(jìn)行發(fā)酵，考察了突變株轉(zhuǎn)化烷烴合成脂肪醇的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

實(shí)驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1，U-204是由熱帶假絲酵母ATCC 20336使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建；質(zhì)粒Tm-gda324-URA3、Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19-T Simple載體，TaKaRa公司；PCR引物，蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成(表2)。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑與儀器

正十二烷醇(色譜級(jí))、正十四烷醇(色譜級(jí))、正己烷(色譜級(jí))、正十二烷、正十三烷、正十四烷，阿拉丁試劑公司；酵母氮基(YNB)、5-氟乳清酸(5-FOA)，生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ATBS)，Sigma公司；一步克隆試劑盒(ClonExpress?II One Step Cloning Kit)，南京諾唯贊生物科技有限公司。

UV-2100型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼科有限公司；PCR擴(kuò)增儀，上海東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；ISQ單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、高速臺(tái)式離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0。

MM培養(yǎng)基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0。

SM培養(yǎng)基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06。

5-氟乳清酸(5-FOA)培養(yǎng)基：在SM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2 g/L 5-FOA。

C+培養(yǎng)基(g/L)：YNB 6.7、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06；根據(jù)需要加入2%(體積分?jǐn)?shù))正十二烷、正十三烷或正十四烷。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、蛋白胨20.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、YNB 6.7、酵母粉6.0、蛋白胨3.0、K2HPO47.2、KH2PO49.3；若配制固體培養(yǎng)基,則再加入20.0 g/L瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 敲除盒構(gòu)建

對(duì)熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組進(jìn)行分析，獲得2對(duì)FAO等位基因，分別為FAO1(FAO11和FAO12)、FAO2(FAO2a和FAO2b)基因，根據(jù)基因序列構(gòu)建敲除盒。以基因FAO11敲除盒構(gòu)建為例，設(shè)計(jì)引物FAO11-F和FAO11-R，以熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組為模板，PCR擴(kuò)增FAO11基因，經(jīng)PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple 載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-FAO11；以質(zhì)粒Ts-FAO11為模板，設(shè)計(jì)引物rFAO11-F和rFAO11-R(分別添加PstⅠ 和XbaⅠ 酶切位點(diǎn))，反向PCR得到片段FAO11U-Ts-FAO11D，凝膠回收該片段，將該片段與質(zhì)粒Tm-gda324-URA3同時(shí)經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和XbaⅠ 消化，再凝膠回收后將片段FAO11U-Ts-FAO11D與片段gda324-URA3連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-FAO11-gda324-URA3。以上述重組質(zhì)粒為模板，用引物FAO11-F和FAO11-R，PCR得到敲除盒FAO11U-gda324-URA3-FAO11D(圖2)。利用相似策略，構(gòu)建其他基因敲除盒，所用引物見(jiàn)表2。

圖2 重組質(zhì)粒Ts-FAO11-gda324-URA3構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Construction of FAO11 disruption plasmid Ts-FAO11-gda324-URA3

1.2.2 脂肪醇氧化酶基因敲除過(guò)程

將敲除盒轉(zhuǎn)入熱帶假絲酵母采用LiCl轉(zhuǎn)化法[14]。以尿嘧啶缺陷型菌株U-204為出發(fā)菌株，以URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，將敲除盒轉(zhuǎn)入宿主內(nèi)，接著涂布到MM固體培養(yǎng)基挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR驗(yàn)證鑒定出正確轉(zhuǎn)化子；將上步正確的轉(zhuǎn)化子涂布到5-FOA培養(yǎng)基，再次挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR初步驗(yàn)證彈出URA3基因后，將PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序，序列比對(duì)無(wú)誤后保藏正確菌株；此方法可以重復(fù)利用篩選標(biāo)記[15-16]。以FAO1基因敲除過(guò)程為例,具體敲除過(guò)程見(jiàn)圖3。

圖3 熱帶假絲酵母FAO1基因敲除流程Fig.3 Sequential gene disruption of FAO1 in C. tropicalis

1.2.3 脂肪醇氧化酶基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

以FAO11基因表達(dá)為例描述具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。以熱帶假絲酵母ATCC 20336基因組為模板，使用引物SFAO11-F和SFAO11-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到FAO11基因的啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和終止子，驗(yàn)證正確并純化后，通過(guò)一步克隆法將線性化的質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3、FAO11基因啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和終止子連接起來(lái)，得到重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11。重組質(zhì)粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a與上述構(gòu)建步驟一致。使用引物CAT1-F和CAT1-R或引物CAT2-F和CAT2-R，以相應(yīng)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后構(gòu)建質(zhì)粒后導(dǎo)入酵母轉(zhuǎn)化，兩者的轉(zhuǎn)化宿主分別為FTYT和2aT2bT菌株。

1.2.4 酵母細(xì)胞在不同碳源的生長(zhǎng)情況

將各菌株在平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到SM培養(yǎng)基，取適量菌液轉(zhuǎn)接到C+培養(yǎng)基中，初始OD600控制在0.10～0.15，每株菌3個(gè)生物學(xué)平行，每隔8 h或12 h測(cè)量一次OD600，84 h時(shí)測(cè)量結(jié)束并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 脂肪醇氧化酶酶活測(cè)定

酶活測(cè)定方法在文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上有所改動(dòng)。將單菌落在SM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接入新鮮SM培養(yǎng)基，加入2%(體積分?jǐn)?shù))十二烷培養(yǎng)2 d后取20 mL菌液離心收集菌體，用50 mmol/L HEPES緩沖液洗滌2次后將菌體在ST緩沖液(細(xì)胞壁水解酶lyticase 緩沖液)中重新懸浮，并添加酵母細(xì)胞壁水解酶至60 U/mL，于30 ℃金屬浴1 h，每隔20 min上下倒置混勻1次。5 000 r/min離心10 min收集原生質(zhì)體，用K3PO4緩沖液洗滌2次，最后重懸在5 mL K3PO4-甘油緩沖液中，使用超聲波破碎儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，總時(shí)長(zhǎng)30 min，然后將細(xì)胞破碎液在4 ℃下37 000 r/min離心30 min，取上清液在4 ℃、100 000 r/min條件下離心1 h收集微粒體后，加入適量K3PO4-甘油緩沖液溶解微粒體后在-20 ℃下保藏，溶解液用作粗酶液，用Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)測(cè)定粗酶液中的總蛋白含量。

最終的反應(yīng)混合物由500 μL的200 mmol/L HEPES緩沖液、50 μL的10 mg/mL ATBS溶液、10 μL的5 mmol/L十二烷醇溶液和5 μL的HRP溶液組成。不同量的細(xì)胞提取物加入反應(yīng)體系，補(bǔ)加去離子水至1 mL。脂肪醇氧化酶酶活測(cè)定在分光光度計(jì)405 nm處，在室溫下進(jìn)行測(cè)量。1個(gè)酶活單位(U)定義為1 min氧化1 μmol底物所需的酶量。對(duì)以1 mmol/L ABTS+·在405 nm處的消光系數(shù)為18.4折算，相當(dāng)于0.5 mmol/L氧化底物。

1.2.6 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將菌株U-204、FTYT、2aT2bT和F3YT在平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到SM培養(yǎng)基，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)2 d后，再以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接到SM液體培養(yǎng)基，同時(shí)加入2%(體積分?jǐn)?shù))正十二烷培養(yǎng)2 d后，以10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)加入2%正十二烷200 r/min、30 ℃培養(yǎng)，每株菌3個(gè)生物學(xué)平行。發(fā)酵開(kāi)始后，0～48 h用2 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4調(diào)pH至5.5～6.0；48 h后每隔12 h調(diào)pH至7.5～8.0，每隔24 h補(bǔ)加2.5%(體積分?jǐn)?shù))甘油(50%)，培養(yǎng)72 h時(shí)補(bǔ)加2%正十二烷，發(fā)酵周期為160 h。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物中脂肪醇的檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)品配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取正十二烷醇和正十四烷醇各30 mg，將兩者溶解于色譜級(jí)正己烷中，配制成終質(zhì)量濃度為30 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品。

M為標(biāo)準(zhǔn)DNA。圖4(a):1～4—質(zhì)粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3雙酶切的結(jié)果。圖4(b):1～4—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO11-gda324 -URA3為模板，F(xiàn)AO11-F和FAO11-R為引物的PCR結(jié)果;5～8—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO12-gda324-URA3為模板，F(xiàn)AO12-F和FAO12-R為引物的PCR結(jié)果。圖4(c):1～4—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2a-gda324-URA3為模板，F(xiàn)AO2a-F和FAO2a-R為引物的PCR結(jié)果； 5～8—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2b-gda324-URA3為模板，F(xiàn)AO2b-F和FAO2b-R為引物的PCR結(jié)果圖4 脂肪醇氧化酶基因敲除菌株的構(gòu)建Fig.4 Disruption of the FAO1 or FAO2 genes disruption in C. tropicalis

發(fā)酵液處理方法。取5 mL發(fā)酵液于離心管中，同時(shí)加入正十四烷醇作為內(nèi)標(biāo)，煮沸加熱15 min用來(lái)破碎細(xì)胞，隨后加入10 mL色譜級(jí)正己烷渦旋振蕩15 min萃取目的產(chǎn)物，12 000 r/min離心5 min，取上層液體1 mL于2 mL進(jìn)樣瓶中，最后通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物[18-19]。

氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。①色譜條件為T(mén)G-WAXMS氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速為1 mL/min,升溫程序：50 ℃保持1 min后，以10 ℃/min速度上升至230 ℃，保持15 min。②質(zhì)譜條件為傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度260 ℃，EI離子源，電子能量70 eV，掃描方式采用EI全掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪醇氧化酶基因突變株的構(gòu)建

構(gòu)建FAO1和FAO2基因敲除盒質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ和XbaⅠ雙酶切分別驗(yàn)證質(zhì)粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3結(jié)果見(jiàn)圖4(a)。理論上預(yù)期片段大小依次為3 504和1 923 bp、3 226和1 923 bp、3 500和1 923 bp以及3 486 bp和1 923 bp的兩條帶。由圖4(a)可知，PCR驗(yàn)證的條帶上的1～4，與理論預(yù)期的大小一致，將它們?cè)偎椭凉緶y(cè)序驗(yàn)證，表明4個(gè)FAO基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功。

用上述重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的敲除盒，將其轉(zhuǎn)入宿主中，挑取轉(zhuǎn)化子，并提取基因組，使用對(duì)應(yīng)同源臂上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4(b)～(c)。理論上應(yīng)擴(kuò)增出2 565、2 547、2 718和2 704 bp的條帶。圖4(b)和(c)的條帶1和5的結(jié)果與理論預(yù)期值一致，表明敲除了FAO1基因和FAO2基因；將轉(zhuǎn)化子彈出URA3基因后再依次用上述引物擴(kuò)增，理論上應(yīng)擴(kuò)增出980、870、1 132和1 118 bp，圖4(b)和(c)的條帶2和6的結(jié)果與理論預(yù)期值一致；圖4(b)和(c)的條帶3與7是以相應(yīng)的出發(fā)菌株為對(duì)照，4與8泳道是以相應(yīng)的敲除質(zhì)粒為對(duì)照。將圖4(b)和(c)中相關(guān)泳道的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了菌株FTYT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324)、2aT2bT(ura3/ura3fao2a::gda324fao2b::gda324)和F3YT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324fao2a::gda324fao2b::gda324)。

2.2 脂肪醇氧化酶基因的回補(bǔ)表達(dá)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11和Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a送至公司測(cè)序，驗(yàn)證正確無(wú)誤后，用上述重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的表達(dá)盒，將其轉(zhuǎn)入相應(yīng)宿主中，挑取轉(zhuǎn)化子，并提取基因組；使用對(duì)應(yīng)的同源臂上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖5。理論上應(yīng)擴(kuò)增出6 389和5 960 bp的條帶。由圖5可知，條帶1和4對(duì)應(yīng)的結(jié)果與理論預(yù)期值一致。條帶2與5是以相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒為對(duì)照，條帶3與5是以相應(yīng)出發(fā)菌株為對(duì)照，由于整合位點(diǎn)是等位基因，因此1和4泳道會(huì)存在和3和6泳道對(duì)應(yīng)的條帶。將圖5相關(guān)泳道的PCR產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了UCF1和UCF2菌株。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA; 1～3—以菌株UCF1、FTYT和質(zhì)粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11為模板， CAT1-F和CAT1-R為引物的PCR 結(jié)果; 4～6—以菌株UCF2、2aT2bT和質(zhì)粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a，CAT2-F和CAT2-R為引物的PCR 結(jié)果圖5 脂肪醇氧化酶基因回補(bǔ)Fig.5 Complementation of fatty alcohol oxidase genes

2.3 突變株在不同碳源條件下的生長(zhǎng)情況

考察各菌株在不同碳源條件下的生長(zhǎng)情況，來(lái)分析FAO基因缺失對(duì)菌株利用碳源的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：當(dāng)以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，各菌株生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯差異；當(dāng)以烷烴(C12～C14)為唯一碳源時(shí)，各菌株的延滯期變長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)情況出現(xiàn)顯著差異，敲除FAO1基因的FTYT菌株生長(zhǎng)速度快于U-204菌株，而敲除FAO2a和FAO2b基因的2aT2bT突變株和組合敲除4個(gè)基因的F3YT菌株生長(zhǎng)都受到明顯抑制，且F3YT只表現(xiàn)出極微弱的生長(zhǎng)；菌株UCF1(FTYT菌株回補(bǔ)FAO11基因)和UCF2(2aT2bT菌株回補(bǔ)FAO2a基因)回補(bǔ)基因后與出發(fā)菌株生長(zhǎng)情況無(wú)顯著差異。在烷烴培養(yǎng)基上，雖然FAO1基因敲除促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，F(xiàn)AO2基因敲除抑制菌株生長(zhǎng)，但是兩個(gè)基因同時(shí)敲除菌株卻幾乎不生長(zhǎng)，這也說(shuō)明了FAO2基因在烷烴代謝過(guò)程中扮演著更為重要的角色。

圖6 不同碳源的對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of carbon sources on strain growth

值得注意的是，當(dāng)FAO1基因敲除后，突變株生長(zhǎng)速度快于出發(fā)菌株，這是很有趣的結(jié)果。有研究表明，熱帶假絲酵母中細(xì)胞色素P450家族中的CYP52A17也可以直接氧化脂肪醇[20]，由此推測(cè)敲除FAO1導(dǎo)致ω氧化途徑中其他酶解除抑制，從而加速烷烴的利用?？傊?，敲除FAO基因敲除會(huì)影響細(xì)胞利用烷烴，F(xiàn)AO1基因的敲除可促進(jìn)細(xì)胞利用烷烴生長(zhǎng)，F(xiàn)AO2基因的敲除卻抑制細(xì)胞利用烷烴生長(zhǎng)，這表明FAO1和FAO2基因的功能存在差異。

2.4 FAO基因缺失對(duì)菌株十二烷醇氧化酶酶活的影響

以正十二烷醇為底物檢測(cè)脂肪醇氧化酶酶活，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知：出發(fā)菌株的比酶活比各基因突變株明顯要高，說(shuō)明FAO1基因的缺失導(dǎo)致脂肪醇氧化酶的酶活顯著下降，比U-204菌株下降近79%；FAO2基因缺失后的菌株脂肪醇氧化酶酶活性損失僅為U-204菌株的37.5%；組合敲除FAO1和FAO2基因后，菌株F3YT中的脂肪醇氧化酶比酶活比FTYT菌株的又一次降低，與U-204菌株相比降低近89%，這表明FAO1與FAO2之間存在差異，與不同菌株對(duì)碳源的利用結(jié)果一致。

圖7 十二烷誘導(dǎo)各菌株的比酶活Fig.7 Dodecane induces specific enzymeactivity of each strain

2.5 FAO基因缺失對(duì)菌株積累脂肪醇的影響

發(fā)酵結(jié)束后，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品同時(shí)采用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知：正十二烷醇與正十四烷醇的保留時(shí)間相差2 min左右，兩峰互不干擾，目標(biāo)產(chǎn)物的離子峰與預(yù)期的一致，并且與標(biāo)準(zhǔn)離子峰比較，鑒定物質(zhì)為正十二烷醇和正十四烷醇。

圖8 氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)酵產(chǎn)物Fig.8 GC-MS analysis of products

通過(guò)計(jì)算得到各菌株積累的正十二烷醇含量，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知：U-204菌株與2aT2bT菌株幾乎不積累正十二烷醇，分別為0.13和0.21 mg/L；FTYT菌株和F3YT菌株積累不同含量的正十二烷醇，分別為9.73和59.63 mg/L；與出發(fā)菌株相比，單獨(dú)敲除FAO1基因就可以積累少量正十二烷醇，單獨(dú)敲除FAO2基因幾乎不積累目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)敲除FAO1和FAO2基因?qū)е抡榇挤e累量顯著提高，是FTYT菌株的6倍左右，是出發(fā)菌株的近460倍。

圖9 FAO1和FAO2基因敲除對(duì)正十二烷醇積累的影響Fig.9 Effects of FAO1 and FAO2 genes disruption on 1-dodecanol production in C. tropicalis

當(dāng)FAO2基因單獨(dú)敲除后，幾乎不積累目標(biāo)產(chǎn)物，但在FAO1基因敲除的基礎(chǔ)上在敲除FAO2基因，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量得到顯著提升，這與前面研究的結(jié)果一致。脂肪醇到脂肪醛這一步的催化，還存在脂肪醇脫氫酶(ADH)負(fù)責(zé)脂肪醇的氧化，并且FAO與ADH基因在細(xì)胞內(nèi)分布的位置不同，功能之間也存在差異[21-22]。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪醇大多數(shù)是通過(guò)代謝工程改造大腸桿菌或酵母，以葡萄糖為底物合成脂肪醇[18,23]，而熱帶假絲酵母能夠利用烷烴合成二元酸，脂肪醇氧化酶FAO是二元酸合成途徑中催化脂肪醇到脂肪醛的關(guān)鍵酶，通過(guò)敲除脂肪醇氧化酶編碼基因FAO理論上能夠?qū)崿F(xiàn)脂肪醇的積累，為脂肪醇的生產(chǎn)提供了一條新思路。本論文結(jié)果也證明了我們的推測(cè)，但脂肪醇的產(chǎn)量相對(duì)較低，依然有很大提升空間，可以在F3YT菌株的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)相關(guān)CYP與CPR酶基因，同時(shí)敲除有關(guān)ADH基因來(lái)提升脂肪醇含量。綜上所述，F(xiàn)AO1基因和FAO2基因在細(xì)胞烷烴代謝中具有重要作用，基因缺失可導(dǎo)致菌株積累脂肪醇，可以將其作為代謝工程改造熱帶假絲酵母生產(chǎn)脂肪醇的潛在靶點(diǎn)。

3 結(jié)論

對(duì)熱帶假絲酵母ω-氧化途徑中的FAO基因進(jìn)行敲除及回補(bǔ)，成功構(gòu)建了不同突變菌株；選擇不同碳源考察缺失FAO基因后菌株的生長(zhǎng)情況以及胞內(nèi)相應(yīng)酶活變化以及以烷烴為底物轉(zhuǎn)化脂肪醇的能力，獲得以下主要結(jié)論：

1)FAO基因在熱帶假絲酵母細(xì)胞烷烴代謝烷烴中具有重要作用，F(xiàn)AO1或FAO2基因缺失對(duì)細(xì)胞利用烷烴產(chǎn)生不同的影響，兩者功能存在差異。

2)FAO基因缺失可導(dǎo)致熱帶假絲酵母積累脂肪醇，F(xiàn)3YT菌株可以積累正十二烷醇59.63 mg/L，是出發(fā)菌株的近460倍。FAO基因可作為改造熱帶假絲酵母生產(chǎn)脂肪醇的潛在靶點(diǎn)。