羊口瘡病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR法的建立

張敏，楊丹嬌，藍嵐，劉怡雯，葉忠明

（四川省甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川康定 626000）

羊口瘡又稱羊傳染性膿皰，是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的一類人獸共患接觸性傳染病。該病多見于小反芻獸，其中羊群最為易感。羊口瘡病毒屬于痘病毒科、副痘病毒屬，該病毒具有很強的嗜上皮性，感染羊病程初期主要表現(xiàn)為口唇、舌、鼻部出現(xiàn)紅疹，進而表現(xiàn)為張口呼吸、口腔分泌物增多、流涎、采食減少，病程后期食欲廢絕，感染部位有明顯的水泡、膿皰、糜爛，最后形成結(jié)痂［1］。該病分布廣泛，澳大利亞、新西蘭、意大利、印度、韓國等均有羊口瘡發(fā)病的報道［2］。近年來我國大力發(fā)展養(yǎng)羊業(yè)，羊只交易頻繁，加速了該病在我國各地區(qū)的發(fā)生。有報道我國甘肅、新疆等省份發(fā)生過該病［3］。

注射疫苗是預(yù)防該病的有效方法，但是我國至今還沒有ORF商品化疫苗，疫苗研究還處于實驗室評估階段［4］。因此，及時準(zhǔn)確地診斷該病，并對患病羊進行隔離和對癥治療，是阻止該病擴散的有效途徑。目前，用于診斷ORF的方法主要有電子顯微鏡檢查、血清學(xué)方法、PCR擴增、LAMP技術(shù)等［5］。SYBR Green Ι 實時熒光定量PCR和常規(guī)方法相比，具有特異性強、靈敏度高等突出優(yōu)勢［6］。本試驗基于臨床上快速高通量檢測OR?FV的需求，建立了快速檢測ORFV DNA的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法。

1 材料

1.1 毒株 羊口瘡病毒四川毒株（ORFV-SC）由西南民族大學(xué)實驗室分離鑒定并保存。山羊痘疫苗、綿羊痘疫苗均由西南民族大學(xué)實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA Bio-Tek公司；SYBR Premix Ex Taq ΙΙ試劑、DL2000 DNA Ladder、膠回收試劑盒、pMD19-T載體、DH5-α感態(tài)細(xì)胞均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；電泳瓊脂糖購自O(shè)xoid公司；島津紫外可見分光光度計BioSpec-nano購自島津企業(yè)管理（中國）有限公司；熒光定量96孔PCR儀，購自杭州博日科技有限公司。

1.3 引物 參照文獻［7-8］合成擴增B2L全長基因的特異性引物；參照GenBank中登錄的ORFV B2L全基因（登錄號：MK645803.1），運用Primer 7設(shè)計熒光特異性引物（表1）。兩對特異性引物均由生工生物工程有限公司合成。

表1 引物信息表

2 方法

2.1 羊口瘡病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建及測序鑒定以O(shè)RFV-SC毒株DNA為模板，PCR特異性擴增出B2L全長基因（1 137 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下陽性條帶。根據(jù)凝膠回收試劑盒說明書回收目的DNA，后將目的片段與pMD19-T載體連接，構(gòu)建含B2L基因的重組質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，劃線培養(yǎng)于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上。37℃恒溫過夜，盲挑轉(zhuǎn)化生長的菌落進行培養(yǎng)。根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并以其為模板進行常規(guī)PCR鑒定，然后將菌液送檢測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAStar和BLAST比對，比對正確的作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 羊口瘡病毒重組質(zhì)粒濃度和純度的測定及拷貝數(shù)的換算 利用島津紫外可見分光光度計測定質(zhì)粒DNA樣品液的質(zhì)量濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)。計算公式如下：拷貝數(shù)（copies/μL）＝OD260×50×稀釋倍數(shù)×10-9×6.02×1023/（660×堿基數(shù)）。

2.3 SYBR Green Ι 實時熒光定量PCR最佳引物濃度的篩選 20 μL體系：SYBR Premix Ex Taq ΙΙ（含SYBR Green Ι）10 μL，以重組陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，取2 μL模板，10 μmol/L的上下游引物各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μL（20 μL反應(yīng)體系中所對應(yīng)的終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol/L），添加ddH2O補足20 μL體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；然后95 ℃5 s，60 ℃45 s，共40個循環(huán)，以篩選最佳引物濃度。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以不同稀釋度拷貝數(shù)（2.13×102～2.13×108copies/μL）質(zhì)粒作為模板，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行擴增，以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，推導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。

2.5 特異性和靈敏性試驗

2.5.1 特異性試驗 用建立好的方法對山羊痘病毒、綿羊痘病毒以及羊口瘡病毒的核酸進行檢測。

2.5.2 靈敏性試驗 對重組質(zhì)粒陽性標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍系列（2.13×108～2.13×10-1copies/μL）稀釋，將稀釋的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別進行實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測，比較兩者的靈敏性。

2.6 重復(fù)性試驗 用優(yōu)化好的反應(yīng)條件分別對3個稀釋度（2.13×104～2.13×106copies/μL）的陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品進行檢測，每個稀釋度同時進行3次重復(fù)檢測。上述陽性標(biāo)準(zhǔn)品于-80 ℃保存，間隔一周進行復(fù)檢，共檢3次，依據(jù)Ct值計算變異系數(shù)。

2.7 臨床樣品的檢測 從頻發(fā)羊口瘡的某山羊養(yǎng)殖場采集180份血清進行羊口瘡病毒檢測，用已建立的SYBR Grenn I實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR分別進行檢測，比較陽性檢出率。

3 結(jié)果

3.1 ORFV B2L全長基因擴增及克隆鑒定結(jié)果 采用ORFV B2L特異性引物擴增出了約11 00 bp的PCR產(chǎn)物（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符合。pMD19-T載體陽性克隆菌的測序結(jié)果經(jīng)DNAstar和BLAST比對，其目的基因已經(jīng)克隆到pMD19-T載體，表明成功構(gòu)建了含B2L基因的重組質(zhì)粒。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

3.2 重組質(zhì)粒陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度測定及拷貝數(shù)換算結(jié)果 經(jīng)測定，重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為91.03 ng/μL，OD260/OD280為1.97。計算得出重組質(zhì)粒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為2.13×1010copies/μL。

3.3 最佳引物濃度篩選結(jié)果 采用優(yōu)化好的循環(huán)條件，對引物終濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol/L進行優(yōu)化，結(jié)果得出當(dāng)引物濃度為0.5 μmol/L時能擴增出標(biāo)準(zhǔn)曲線，且有最小的Ct值和最大的熒光值。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別以不同稀釋度拷貝數(shù)（2.13×102～2.13×108copies/μL）質(zhì)粒作為模板，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行擴增，獲得擴增曲線（圖1），以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

3.5 特異性試驗 采用建立的ORFV SYBR Green I實時熒光定量PCR方法對山羊痘病毒（GPV）和綿羊痘病毒（SPV）核酸進行特異性檢測，結(jié)果均未擴增出，而山羊口瘡病毒具有良好的擴增曲線（圖4），表明所建立的方法特異性強。

3.6 敏感性試驗 由圖5可知，實時熒光定量PCR和常規(guī)PCR的最低檢測限分別為2.13×101、2.13×103copies/μL，表明ORFV SYBR Green I實時熒光定量PCR方法的靈敏度優(yōu)于常規(guī)PCR方法。

圖2 ORFV SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增曲線

圖3 ORFV SYBR Green I實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 SYBR Green I實時熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

圖5 敏感性試驗結(jié)果

3.7 重復(fù)性試驗 將重組質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，選取2.13×104、2.13×105、2.13×106copies/μL 3個稀釋度進行實時熒光定量PCR擴增，計算得出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)分別為0.437%～1.061%、0.554%～1.104%（表1），批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2.5%，表明該方法的重復(fù)性好。

3.8 臨床樣品檢測情況 檢測180份山羊血清，常規(guī)PCR的陽性檢出率為2.8%（5/180）（圖6），實時熒光定量PCR的陽性檢出率為4.4%（8/180）。常規(guī)PCR檢出的5份陽性樣品，采用實時熒光定量PCR也都能檢出。

表1 實時熒光定量PCR的Ct值

圖6 常規(guī)PCR檢測的ORFV臨床血液樣本

4 結(jié)論與分析

羊口瘡病毒編碼區(qū)中間部分為中心保守區(qū)，兩端為末端變異區(qū)，而B2L基因位于羊口瘡病毒第11個完整開放閱讀框，高度保守［9］。本試驗基于B2L基因合成一對特異性引物，用于構(gòu)建羊口瘡SYBR Green I實時熒光定量PCR法，結(jié)果表明該方法特異性強、重復(fù)性好，無引物二聚體和非特異性擴增。

本試驗所建立的實時熒光定量PCR法，在靈敏度檢測中的最低檢測限可達2.13×101copies/μL，相較于某些文獻報道的同一方法高出數(shù)倍。出現(xiàn)這樣的比對結(jié)果，是因為DNA的純度存在一定差異。本試驗建立的羊口瘡病毒B2L基因重組質(zhì)粒，經(jīng)測定所得純度高，而從組織病料和細(xì)胞中提取的病毒DNA存在細(xì)胞DNA和RNA的雙重污染，由于目的DNA的純度不高，使得所建立方法的靈敏度降低。

PCR的檢測結(jié)果常作為目標(biāo)基因存在與否的重要依據(jù)。引物的特異性是PCR檢測是否準(zhǔn)確的前提。但是在實際操作中往往發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，經(jīng)常出現(xiàn)無條帶、無目的條帶或多條帶的現(xiàn)象，此時很難分辨是否存在引物二聚體或者引物和DNA的錯配，而熒光定量PCR可以通過分析熔解曲線，從而確定是否存在引物設(shè)計不合理的情況。本研究建立的實時熒光定量PCR方法經(jīng)熔解曲線分析只出現(xiàn)單一特異性峰，證明設(shè)計的引物特異性好。

實時熒光定量PCR依據(jù)其自身的優(yōu)越性已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域［10］。對于羊口瘡，建立快速的檢測方法可及時確定病原，從而為ORF的防控提供依據(jù)。本研究構(gòu)建的ORFV實時熒光定量PCR法，適用于羊口瘡的臨床檢測。■