擬南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物學(xué)信息分析及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

韋 春，楊莉琴，秦利軍

(貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BRs)是植物體內(nèi)油菜素類固醇物質(zhì)的總稱，作為一種重要的類固醇激素，BRs調(diào)節(jié)植物多種生理生化反應(yīng)，被稱為植物界的第六大激素[1]。BRs除可調(diào)控植物生長(zhǎng)與發(fā)育外，還能提高植物對(duì)外界脅迫環(huán)境的適應(yīng)力，增強(qiáng)植株應(yīng)答多種不良環(huán)境因素的抵抗力及耐受力[2-4]。目前，已知關(guān)于BRs合成的通路途徑主要包括兩條，即CN-依賴途徑(CN-dependent pathway)和不依賴于CN的合成途徑(CN-independent pathway)[5-6]。在CN-依賴途徑中，蕓苔甾醇(campesterol，CR)作為起始物，經(jīng)過(guò)一系列氧化還原反應(yīng)形成油菜烷醇(campestanol，CN)，CN又可通過(guò)早期的C-6氧化途徑和晚期的C-6氧化途徑形成蕓苔甾內(nèi)酯(brassinolide，BL)BL的直接前體油菜素甾酮(castasterone，CS)[5]。研究表明，在水稻(Oryzasativa)、擬南芥(A.thaliana)和煙草(Nicotianatabacum)中主要存在的是晚期C-6氧化途徑[7]。在晚期C-6氧化反應(yīng)途徑中，CN經(jīng)由C-22羥基化反應(yīng)得到非氧化形式(cathasterone，CT)，下一步再形成睪丸酮(teasterone，TE)，經(jīng)過(guò)類似早期C-6氧化反應(yīng)途徑，最后在C-6氧化得到CS。另一條途徑是不依賴于CN的合成途徑(CN-independent pathway)，CR通過(guò)不形成CN的八步催化反應(yīng)形成BL，即CR依次經(jīng)過(guò)DWF 4、CPD、DET 2、ROT 3/CYP 90 D 1、PsDDWF 1、BR 6 ox 1/2等多種酶的催化形成最終產(chǎn)物BL[5]。由此可見(jiàn)，無(wú)論是在何種通路中，DWF4基因均編碼限速關(guān)鍵酶，調(diào)控著整個(gè)BRs的生物合成。早期研究表明，在擬南芥中，該基因被定位于3號(hào)染色體的短臂上，與A.thalianaCPD有66%序列相似性[8]。另有研究表明，DWF4是一種22-α羥基化酶，超量表達(dá)DWF4編碼基因能顯著增加BRs含量，引起A.thaliana花序和下胚軸長(zhǎng)度明顯伸長(zhǎng)，提高種子產(chǎn)量[9]。本研究主要以A.thaliana植株為材料，以cDNA為模板對(duì)AtDWF4基因進(jìn)行同源克隆，分析基因的結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)蛋白功能；同時(shí)，構(gòu)建含AtDWF4基因的過(guò)表達(dá)載體并導(dǎo)入煙草K 326，為進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)AtDWF4基因?qū)D(zhuǎn)基因煙株形態(tài)及抗脅迫能力提供理想實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子，大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)菌株DH 5α，均由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存并提供。Plant RNA Kit購(gòu)于Bio-Tek OMEGA公司，膠回收試劑盒購(gòu)自Invitrogen Ambion公司，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，DNA 5 000 bp Marker，T4DNA ligase、DNA 2 000 bp Marker和pRI 201-AN植物表達(dá)載體均購(gòu)于Takara公司；Plant RNA Kit購(gòu)于Bio-Tek OMEGA公司，MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit均購(gòu)自Applied Biosystems公司；GelRedTM10 000×購(gòu)于BIOTIUM公司；X-Gal、IPTG、氨芐青霉素(ampicillin，AMP)均購(gòu)于Sigma-Aldich公司；克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；目標(biāo)片段測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1擬南芥cDNA的制備及AtDWF4克隆

取擬南芥植株幼嫩的葉片，按照植物總RNA提取試劑盒Plant RNA Kit提供的方法，提取擬南芥植株的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：10×RT Buffer 2.0 μL，25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL，10×RT Random Primers 2.0 μL，RNA inhibitor 1.0 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，Nucleasefree H2O 3.2 μL，RNA template 10.0 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min；4 ℃保持。之后以cDNA為模板，以特異性引物DWF4-F(5′-ATGTTCGAAACAGAGCATCATACTCTCTTAC C-3′)和DWF 4-R(5′-TTACAGAATACGAGAAACCCTAATAGGCAAACCG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)是否擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。

1.2.2目標(biāo)片段連接及測(cè)序

按照Invitrogen Ambion公司膠回收試劑盒操作方法操作，回收PCR擴(kuò)增的特異性條帶并純化。參照Promega公司pGEM-T Easy Vector Systems試劑盒說(shuō)明將純化的DNA片段連接入克隆載體并導(dǎo)入感受態(tài)E.coliDH 5α中，利用藍(lán)白斑篩選法挑選陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 7.0軟件對(duì)基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸組成分析；利用ProtParam軟件對(duì)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；利用在線工具ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)對(duì)蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4構(gòu)建載體

以pRI 201-AN為原始載體(圖1)，利用KpnⅠ/NotⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pRI 201-AN和人工合成的、兩端(5′和3′)有KpnⅠ和NotⅠ位點(diǎn)的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表達(dá)元件。該表達(dá)元件以植物逆境脅迫特異表達(dá)基因rd29A啟動(dòng)子(Prd29A)驅(qū)動(dòng)AtDwf4基因表達(dá)、以熱激蛋白(heat shock protein，HSP)基因終止序列(THSP)終止表達(dá)的表達(dá)框。分別回收pRI 201-AN雙酶切的大片段，含有Prd29A∷AtDwf4∷THSP表達(dá)元件的小片段，在T4DNA連接酶的作用下，4 ℃過(guò)夜連接，連接載體經(jīng)雙酶切鑒定后分別導(dǎo)入感受態(tài)E.coliDH 5α和感受態(tài)AgrobacteriumtumefaciensLBA 4404中，獲得工程菌。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

參照譚穎等[10]的方法對(duì)煙草K 326進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。侵染葉片置于共培養(yǎng)基MS1(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA)上，26～28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。共培結(jié)束后，葉塊轉(zhuǎn)移至脫菌篩選培養(yǎng)基MS2(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+100 mg·L-1Kanamycin+150 mg·L-1Timentin)上，25 ℃，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)2周，以誘導(dǎo)抗性芽分化。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtDWF4基因克隆及測(cè)序

通過(guò)同源克隆，從A.thaliana擴(kuò)增到一條1 000～2 000 bp的亮帶，該片段依次經(jīng)電泳、回收、T載體連接和大腸桿菌導(dǎo)入后送華大基因科技有限公司測(cè)序。利用DNAMAN 7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、連接，得到全長(zhǎng)為1 542 bp的基因序列(圖2)。

2.2 AtDWF4基因編碼序列分析

序列分析表明，AtDWF4基因可編碼513個(gè)氨基酸；在線Protparam軟件預(yù)測(cè)AtDWF 4蛋白等電點(diǎn)為6.62，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為66個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為63個(gè)，即帶電荷氨基酸為129個(gè)，占25.15%(weight)；酸性氨基酸66個(gè)，占12.87%(weight)；堿性氨基酸63個(gè)，占12.28%(weight)；非極性氨基酸222個(gè)，占43.27%(weight)；親水性氨基酸146個(gè)，占28.46%(weight)。分子式簡(jiǎn)寫(xiě)為：C2661H4156N716O757S18；在線軟件Proscale預(yù)測(cè)AtDWF 4蛋白在氨基酸第22、23、24位疏水性達(dá)到高峰，最大值為3.256；在第258位親水性達(dá)到高峰，最大值為-3.544；總平均疏水指數(shù)為-0.301，推測(cè)擬南芥DWF 4蛋白可能為親水性蛋白(圖3)。

2.3 AtDWF 4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用TMpred軟件在線分析DWF 4蛋白跨膜區(qū)域，表明該蛋白存在3個(gè)跨膜區(qū)域，分別是第9位氨基酸到第28位氨基酸，方向?yàn)閕-o；第112位氨基酸到第130位氨基酸，方向?yàn)閛-i；第308位氨基酸到330位氨基酸，方向?yàn)閕-o。SOPM法預(yù)測(cè)DWF 4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure of protein)主要含有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等(圖4)。

2.4 pRI 201-RdDwf 4植物表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以KpnⅠ/NotⅠ雙酶切原始植物表達(dá)載體pRI 201-AN和人工合成的兩端含一致酶切位點(diǎn)的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表達(dá)框。酶切大小片段在T4DNA連接酶作用下得到植物表達(dá)載體pRI 201-RdDwf 4。同時(shí)，利用KpnⅠ/NotⅠ對(duì)構(gòu)建的植物表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，獲得2 552 bp(其中，Prd29A序列827 bp，AtDWF4序列1 542 bp；THSP序列183 bp)和10 432 bp兩條帶，證明該表達(dá)框已經(jīng)成功導(dǎo)入原始表達(dá)載體(圖5)。

2.5 煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究

利用凍融法將載體pRI 201-RdDwf 4轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA 4404，以葉圓盤(pán)轉(zhuǎn)化法[18]對(duì)煙草K 326葉片受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。煙草葉片依次經(jīng)侵染、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)得到葉緣出現(xiàn)分化的愈傷組織，且愈傷組織結(jié)構(gòu)致密、呈淺綠色，另部分愈傷已分化出抗性芽(圖6)。

3 討 論

BRs作為存在于植物體內(nèi)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有眾多影響的一類激素，其中最重要的作用就是調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和增強(qiáng)植物對(duì)外界環(huán)境的脅迫反應(yīng)抵抗能力[12-14]。它參與調(diào)控植物的光形態(tài)建成、細(xì)胞分裂和分化、生殖發(fā)育、開(kāi)花、衰老等多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，減輕植物因生物或非生物脅迫受到的傷害[15-17]。目前，已知的關(guān)于BRs生物合成的關(guān)鍵酶有DET 2、CPD、DWF 4、ROT 3、CYP 90 D 1、BR 6 ox 1和BR 6 ox 2[18]。有研究報(bào)道，DWF4基因的過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致內(nèi)源BR的水平升高，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[19]。本研究以擬南芥植株為材料，提取該植物的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以擬南芥cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物DWF 4 F/R對(duì)AtDWF4基因進(jìn)行同源克隆，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)AtDWF4基因。以KpnⅠ/NotⅠ同時(shí)雙酶切植物表達(dá)載體pRI 201-AN和含有KpnⅠ和NotⅠ位點(diǎn)的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表達(dá)元件，該表達(dá)元件5′和3′端分別含有KpnⅠ和NotⅠ，經(jīng)酶切后分別回收大片段和小片段，純化后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，通過(guò)酶切驗(yàn)證后構(gòu)建DWF4基因的過(guò)表達(dá)載體pRI 201-RdDwf 4，成功構(gòu)建了pRI 201-RdDwf 4植物表達(dá)載體，為今后對(duì)DWF4基因的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。