22C3位點(diǎn)PD-L1與ki67 EGFR和血液指標(biāo)相關(guān)性研究

冒學(xué)蓮， 王承霞， 陳 艷， 賈張軍， 竺明晨

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所， 江蘇 南京 210009)

近年來，肺癌發(fā)病率及致死率逐年上升，躍居首位，成為腫瘤患者的“第一殺手”，非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占原發(fā)性肺癌的80%。為了延長患者生命，提高生存率以及改善預(yù)后，NSCLC非手術(shù)性治療，漸漸從靶向在向免疫治療方向發(fā)展，由NSCLC晚期的標(biāo)準(zhǔn)二線治療，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o驅(qū)動(dòng)基因改變，PD-L1高表達(dá)的一線治療，改變的治療策略，開啟了肺癌新時(shí)代的精彩篇章。PD-L1通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞因子表達(dá)，傳遞共刺激信號(hào)通路，減少細(xì)胞免疫應(yīng)答，降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和清除，腫瘤由此發(fā)生、發(fā)展。多篇文獻(xiàn)指出PD-L1的過表達(dá)與較差的臨床指標(biāo)相關(guān)[1]。PD-L1高表達(dá)可能成為預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物[2]，研究NSCLC患者PD-L1的表達(dá)情況與患者的臨床病理特征、ki67、EGFR預(yù)后有關(guān)因素之間的相關(guān)性，對(duì)NSCLC患者的治療與預(yù)后將產(chǎn)生重要的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料:收集江蘇省腫瘤醫(yī)院2018年11月至2019年7月的臨床病理資料完整的，且經(jīng)病理學(xué)確診為NSCLC組織標(biāo)本121例。男性91例，女性30例。年齡37～90歲，中位年齡63歲。60歲以下的占33.1%。73.6%(89/121)的患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。14.9%(18/121)的患者有時(shí)吸煙，85.1%的患者從不吸煙。根據(jù)2016年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)新的修訂標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行NSCLC的TNM分期[12]，其中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期103例。腺癌76例，其他45例為鱗癌、腺鱗癌，神經(jīng)內(nèi)分泌癌等。分化程度：高分化11例、中分化34例、低分化76例；病人血液檢驗(yàn)結(jié)果均為入院采血第一次所得。研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2組織標(biāo)本免疫組化:4μm石蠟切片，二甲苯脫蠟至水、2min高溫高壓抗原修復(fù)、3% H2O2進(jìn)行封閉，按照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司公司試劑盒說明書進(jìn)行分別加入一抗Ki67工作液和單克隆鼠抗人PD-L1(22C3)，封片均設(shè)陽性和陰性對(duì)照，陰性對(duì)照為PBS代替一抗。在對(duì)應(yīng)的DAKO Link 48診斷平臺(tái)，PD-L1染色結(jié)果判定根據(jù)腫瘤細(xì)胞(TC)呈現(xiàn)任何強(qiáng)度細(xì)胞膜染色(PD-L1)的占比，<1%為陰性；1～49%為低表達(dá)；≥50%為高表達(dá)。所有切片均由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理診斷醫(yī)生，至少2名進(jìn)行切片判定。

1.3EGFR基因突變的檢測(cè):采用EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(ARMS法)，檢測(cè)EGFR基因18、19、20、21外顯子突變，嚴(yán)格參照說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)束后分析結(jié)果。

1.4血清各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè):清晨抽取所有受試者，空腹靜脈血5mL于試管中，混勻備用。采用emiBioCytoCounter系列全自動(dòng)可視化細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)CD3+,、CD4+、CD8+T細(xì)胞比例。采用羅氏全自動(dòng)生化分析儀P800和電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀E601及配套試劑分別檢測(cè)血清LDH、CEA、CA199、CY211水平。嚴(yán)格參照操作流程進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:研究所得數(shù)據(jù)錄入SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PD-L1與各指標(biāo)陽性表達(dá)率:所有患者均行PD-L1檢測(cè)。PD-L1陽性表達(dá)率分別為61.2%(74/121)，低表達(dá)率38.0%(46/121)高表達(dá)率23.2%(28/121)。101例患者進(jìn)行Ki67免疫組化，Ki67高表達(dá)占56.4%(57/101)。48例患者進(jìn)行了EGFR基因檢測(cè)，其中陽性突變者占41.7%(20/48)。119例患者行CEA檢測(cè)，異常率為64.7%(77/119)。108例患者行CA125檢測(cè)，異常率為51.9%(56/108)。119例患者行LDH檢測(cè)，異常率為17.6%(21/119)，71例患者行CY211檢測(cè)，異常率為64.8%(46/71)。見表1。

表1 肺癌各項(xiàng)指標(biāo)的異常(高)表達(dá)率

2.2PD-L1表達(dá)與肺癌的臨床病理特征的關(guān)系:Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PD-L1陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ+Ⅱ和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.636、7.726，P<0.05)，不同年齡、性別、病理類型、吸煙情況、分化情況，PD-L1陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1表達(dá)與肺癌的臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3EGFR、免疫組化與血清各項(xiàng)指標(biāo)的對(duì)PD-L1陽性表達(dá)率相關(guān)性:PD-L1陽性表達(dá)率與EGFR突變型、Ki67高表達(dá)、CD8+T細(xì)胞數(shù)量增高和LDH增高具有顯著相關(guān)性。呈正相關(guān)(P<0.05)，而與CY211增高、CEA增高和CD4+T細(xì)胞數(shù)量異常未見明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 PD-L1表達(dá)與肺癌的其他指標(biāo)的相關(guān)性(n)

3 討 論

PD-L1是定位于人染色體9q24，編碼290個(gè)氨基酸的穿膜蛋白，表達(dá)于大部分腫瘤細(xì)胞及免疫細(xì)胞表面，巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞[3]。PD-1/ PD-L1是近年來研究較熱的負(fù)性免疫共刺激分子，抑制細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制了腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的免疫活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，從而逃避T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成。PD-1與PD-L1在實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[2]。本研究PD-L1陽性表達(dá)率為61.2%，略高于Lin[4]等研究，PD-L1在肺癌腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)53.6%，差異可能與研究對(duì)象選擇不同有關(guān)。

本文研究結(jié)果顯示，Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者PD-L1陽性表達(dá)率顯著增高。與Koh等報(bào)告相吻合[5]，肺腺癌中PD-L1與TNM臨床分期呈正性相關(guān)。在NSCLC中，PD-L1與PD-1結(jié)合后，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，降低CD8+T細(xì)胞的糖酵解，抑制活化增殖，逃避監(jiān)視和殺傷，導(dǎo)致患者病情進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分期高，迅速惡化[6]。PD-L1與肺癌病情發(fā)展和轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，肺癌分期較高患者中PD-L1表達(dá)水平更高，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1提示侵襲性高、分期較晚。

本研究中高表達(dá)PD-L1與部分免疫組化分子、血液分子物質(zhì)具有顯著相關(guān)性，如LDH、EGFR基因突變、Ki67表達(dá)和CD8+T細(xì)胞。與諸多研究結(jié)果相一致。Tang等[7]發(fā)現(xiàn)晚期肺腺癌中PD-L1高表達(dá)，EGFR突變型PD-L1高表達(dá)率顯著提高71.9%；TKIs治療EGFR突變型高表達(dá)PD-L1患者預(yù)后更好。Reck[8]and Rittmeyer[9]研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者其免疫治療，療效顯著差于EGFR野生型。EGFR屬于肺癌的驅(qū)動(dòng)基因，原癌基因的激活和抑癌基因的失活，免疫微環(huán)境細(xì)胞因子誘導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞的分化、增殖、凋亡發(fā)生異常，高增殖率，高異質(zhì)性的肺癌發(fā)生，EGFR調(diào)控信號(hào)通路，持續(xù)激活誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞PD-L1非炎癥性機(jī)制表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)PD-L1糖基化水平,而不被降解，起穩(wěn)定PD-L1分子的作用。TKI在直接抗腫瘤的同時(shí)，還可以間接抗腫瘤，通過下調(diào)PD-L1表達(dá)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。分析EGFR與PD-L1間的分子聯(lián)系，對(duì)肺癌免疫治療和靶向治療的規(guī)范應(yīng)用，有很大的導(dǎo)向作用。

Ki-67高表達(dá)與PD-L1表達(dá)具有明顯相關(guān)性，Ki-67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的核標(biāo)記物[10]。在肺癌的預(yù)后研究中，Ki-67影響著治療療效，可作為預(yù)后差的標(biāo)志物，在肺癌的免疫逃逸過程中，PD-L1表達(dá)高者，腫瘤細(xì)胞加速增殖，迅速惡化[11]，提示PD-L1高表達(dá)者，病情重，發(fā)展快。

LDH是乳酸脫氫酶，是個(gè)常規(guī)生化指標(biāo)，肺癌患者中LDH升高者，PD-L1表達(dá)率顯著升高。美國AACR在2016年發(fā)布，在使用抗PD-L1抗體治療腫瘤時(shí)，LDH值正常的患者，腫瘤控制率顯著高于LDH值增高的患者。腫瘤細(xì)胞在侵襲發(fā)展的過程中，正常細(xì)胞破裂死亡，釋放出LDH，PD-L1越高，提示惡性程度越高，侵襲力強(qiáng)，LDH值越高，因此PD-L1可能成為肺癌患者生存的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

近年來,以PD-L1/PD-1抑制劑為代表，現(xiàn)在已有鼠來源的22C3，獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)通過，并獲得認(rèn)證，可以應(yīng)用于臨床，用于非小細(xì)胞肺癌的伴隨診斷，篩選癌癥新藥Pembrolizumab單抗，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤免疫療法為無法手術(shù)，或轉(zhuǎn)移的晚期非小細(xì)胞肺癌患者帶來新的希望。SUN等[12]研究Ⅰ期患者PD-L1高表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率顯著提高，ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者PD-L1表達(dá)強(qiáng)陽性與OS較短相關(guān)。Madore[13]等研究提示，PD-L1蛋白表達(dá)提示較差的預(yù)后。深入研究PD-L1在NSCLC的表達(dá)情況，及相關(guān)分子顯得尤為重要。PD-L1與NSCLC病情發(fā)展和轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，抑制T細(xì)胞的活化增殖，進(jìn)而導(dǎo)致病情進(jìn)展或轉(zhuǎn)移，可作為病情程度的判斷指標(biāo)。

本研究存在一些局限性，回顧性分析，樣本量不夠大，所選擇的患者不是有全部的臨床資料，進(jìn)行了EGFR檢測(cè)患者數(shù)量有限，只分析了組織石蠟切片的結(jié)果，未對(duì)血液結(jié)果同步分析；腫瘤個(gè)體異質(zhì)性，導(dǎo)致數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果會(huì)有所偏差；僅選用22C3一種抗體檢測(cè)PD-L1表達(dá)情況，沒有涵蓋多種抗體檢測(cè)結(jié)果，免疫法判定也易受多種因素影響，不能做到標(biāo)準(zhǔn)化；缺乏患者使用Pembrolizumab治療療效的相關(guān)數(shù)據(jù)。隨著抗PD-1/PD-L1免疫治療的臨床應(yīng)用，PD-L1與TNM分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CD8+T細(xì)胞、LDH和Ki67表達(dá)之間關(guān)系，尤其是與EGFR等肺癌驅(qū)動(dòng)基因信號(hào)通路之間的聯(lián)系，進(jìn)一步分析PD-L1表達(dá)在NSCLC患者中的預(yù)后意義，有助于靶向治療與免疫治療的在個(gè)體化，精準(zhǔn)化治療手段中更加合理地規(guī)范使用，最終將肺癌的治療過程向慢性病邁進(jìn)。