二甲雙胍調(diào)控自噬減輕高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞損傷的實驗研究

相 萌， 張旭東， 趙 巧， 趙宗霞

(1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室， 陜西 西安 710021 2.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院拉吉姆實驗室， 陜西 西安 710021) 3.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 陜西 西安 710038)

妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus，GDM)是妊娠期最常見糖代謝疾病，影響3%～30%的妊娠期婦女[1]。GDM可能會導(dǎo)致胎盤發(fā)育不良、促進流產(chǎn)和胎兒畸形等妊娠不良結(jié)局，這可能與高血糖作用相互聯(lián)系。胎盤是正常妊娠及胎兒生長發(fā)育的重要場所，其正常生理功能與絨毛膜滋養(yǎng)層細胞密切相關(guān)[2]。證據(jù)顯示，GDM患者的自噬水平明顯增強，且高葡萄糖水平能夠增強滋養(yǎng)層細胞的自噬和凋亡[3]。宋鴻碧等[4]研究顯示，二甲雙胍聯(lián)合胰島素泵治療GDM患者，能夠有效控制血糖、減少并發(fā)癥，但二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細胞損傷情況的影響及與自噬水平的關(guān)系尚不明確。因此本研究在體外培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)層HTR8-SVneo細胞，建立高糖損傷模型，探討二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)人滋養(yǎng)層細胞的增殖、凋亡、自噬的影響及其作用機制，為將二甲雙胍應(yīng)用于GDM治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1主要材料:人絨毛膜滋養(yǎng)層HTR8-SVneo細胞(ml053596)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片(B14202003084)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(PM150110)、RPMI 1640無糖培養(yǎng)基(PM150122)、胎牛血清(164210-100)、青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)(PB180120)、D-葡萄糖溶液(PB180418)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液(T1350)、噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)(M8180)、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein Isothiocyanate/Propidium Iodide，Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒(CA1020)、RIPA裂解液(R0020)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)、Trizol試劑盒(R1100)、ECL發(fā)光液(PE0010)購自北京Solarbio公司；磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)兔抗人多克隆抗體(PA1-16777)、自噬相關(guān)基因7(autophagy related gene7，ATG7)兔抗人多克隆抗體(PA5-17216)、Beclin-1兔抗人多克隆抗體(PA5-96649)、核孔蛋白(Nucleoporin 62，p62)兔抗人多克隆抗體(PA5-27247)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3 Ⅰ/Ⅱ(Microtubule-associated Protein Light Chain 3 Ⅰ/Ⅱ，LC3Ⅰ/Ⅱ)兔抗人多克隆抗體(PA5-109226)、山羊抗兔IgG(H + L)二級抗體(A32731)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要儀器:二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Herocell 180)購自上海潤度生物科技有限公司；PCR儀(T100)購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀(HBS-1093C)購自南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡購自(MA100N)購自日本Nikon；流式細胞儀(CytoFLEX)購自美國Beckman公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng):將HTR8-SVneo細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗、5.5 mmoL/L葡萄糖)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達90%左右，0.25%胰酶消化、傳代，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2MTT實驗

1.2.2.1高糖誘導(dǎo)模型[5]:將1.2.1培養(yǎng)的HTR8-SVneo細胞隨機分為對照組和高糖組，分別含有D-葡萄糖終濃度：對照組(5.5mmoL/L)；高糖組(10、15、20、30、40mmoL/L)。將各組細胞接種于96孔板(4.5×104個/孔)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔(加入等體積PBS)，培養(yǎng)24h，棄去上清液，加入100μL/孔二甲基亞砜，37℃搖床震蕩10min，用酶標(biāo)儀上測定波長570nm時各孔吸光值(OD值)。計算各組細胞存活率，存活率(%)=(實驗孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)，取50%存活率左右的高糖濃度建立高糖誘導(dǎo)HTR8-SVneo細胞損傷模型。

1.2.2.2二甲雙胍作用后細胞活性檢測:收集1.2.1HTR8-SVneo細胞，隨機分為對照組(5.5mmoL/L D-葡萄糖)、模型組(30mmoL/L D-葡萄糖)、二甲雙胍I組(30mmoL/L D-葡萄糖+1mmoL/L 二甲雙胍)、二甲雙胍Ⅱ組(30mmoL/L D-葡萄糖+5mmoL/L 二甲雙胍)、二甲雙胍Ⅲ組(30mmoL/L D-葡萄糖+15mmoL/L 二甲雙胍)。分別使用含有對應(yīng)二甲雙胍濃度的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR8-SVneo細胞24h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，按照1.2.2.1實驗方法檢測各組細胞存活率。

1.2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡:按照1.2.2.2分組方法，將各組HTR8-SVneo細胞接種于6孔板(1.2×106個/孔)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集各組細胞，PBS清洗2次，離心(1500 r/min，5 min)收集細胞沉淀，500μL Binding Buffer重懸后，依次加入10 μL Annexin V-FITC和PI，混勻、4℃避光靜置20 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。凋亡率(%)=凋亡早期細胞比例+凋亡晚期細胞比例。

1.2.4RT-qPCR實驗:按照Trizol試劑盒說明書提取1.2.3各組HTR8-SVneo細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)處理1min，95℃ 15s，60℃ 30s，共40個循環(huán)，收集熒光信號。以GAPDH為內(nèi)參，利用2-△△Ct法計算Beclin-1 mRNA及ATG7 mRNA基因相對表達量。Beclin-1、ATG7及GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1。

1.2.5蛋白免疫印跡分析實驗:收集1.2.3各組HTR8-SVneo細胞，加入RIPA裂解液(200μL/孔)低溫裂解30min，BCA法測定總蛋白量。取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入稀釋的一抗Beclin-1、ATG7、p62(1∶1000)、LC3Ⅰ/Ⅱ(1∶500)、GAPDH(1∶2000)，4℃孵化過夜，添加稀釋的二抗(1∶5000)孵化2h，洗膜，使用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀成像，利用Image J掃面處理灰度值，分析目標(biāo)蛋白表達情況。

2 結(jié) 果

2.1高糖誘導(dǎo)對HTR8-SVneo細胞增殖抑制作用:與對照組相比，高糖組(15、20、30、40mmoL/L)HTR8-SVneo細胞存活率依次降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組HTR8-SVneo細胞存活率

2.2二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)的HTR8-SVneo細胞存活率影響:與對照組相比，模型組HTR8-SVneo細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍I組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組HTR8-SVneo細胞存活率依次升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表3。

表3 二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)的HTR8-SVneo細胞存活率影響

2.3二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)的HTR8-SVneo細胞凋亡影響:與對照組相比，模型組HTR8-SVneo細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍I組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組HTR8-SVneo細胞凋亡率依次降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖1、表4。

圖1 二甲雙胍對高糖誘導(dǎo)的HTR8-SVneo細胞凋亡的影響

表4 二甲雙胍作用后高糖誘導(dǎo)的HTR8-SVneo細胞凋亡率變化

2.4二甲雙胍對各組細胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表達影響:與對照組相比，模型組HTR8-SVneo細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍I組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組HTR8-SVneo細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值依次降低(P<0.05)，p62蛋白表達水平依次升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖2，表5。

圖2 各組HTR8-SVneo細胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表達電泳圖

表5 二甲雙胍對各組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62表達影響

圖3 各組HTR8-SVneo細胞中Beclin-1、ATG7蛋白表達電泳圖

表6 二甲雙胍對各組細胞Beclin-1 ATG7 mRNA及蛋白表達影響

2.5二甲雙胍對各組HTR8-SVneo細胞Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表達的影響:與對照組相比，模型組HTR8-SVneo細胞Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍I組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表達量依次降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖3，表6。

3 討 論

GDM患者在妊娠期間的糖耐量會顯著降低，主要表現(xiàn)為高血糖癥和碳水化合物代謝紊亂，發(fā)病率高達17.7%[6]。母親血糖升高會導(dǎo)致胎兒胰島素分泌增加，從而引起巨人癥、剖宮產(chǎn)的風(fēng)險，此外，GDM易使后代換上心血管病、肥胖和糖尿病等疾病。目前，GDM的治療有飲食管理、運動治療和藥物治療等，可以減少但不能預(yù)防GDM不良后果，因此開發(fā)新的治療方式具有臨床研究意義[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖各組HTR8-SVneo細胞存活率依次降低，當(dāng)D-葡萄糖濃度大于30mmoL/L，細胞損傷嚴(yán)重(大于50%)，不利用后續(xù)實驗的進行，因此本實驗選擇30mmoL/L作為建立高糖誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞損傷模型的最佳濃度。

二甲雙胍是臨床應(yīng)用廣泛的口服降糖藥物之一，已被證實可以預(yù)防或延遲患有糖尿病的孕婦發(fā)展為Ⅱ型糖尿病[8]。二甲雙胍在治療GDM中發(fā)揮重要作用，其聯(lián)合胰島素能夠良好的控制妊娠期婦女的血糖水平。Gray等[9]調(diào)查顯示，二甲雙胍治療GDM有利于母親和胎兒長期安全。Vega等[10]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍預(yù)處理能夠防止胰島素誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細胞存活率降低和細胞凋亡。本結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組HTR8-SVneo細胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高，提示損傷模型建立成功；與模型組相比，二甲雙胍I組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組HTR8-SVneo細胞存活率依次升高、凋亡率依次降低，呈劑量依賴性，提示二甲雙胍能夠降低高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細胞損傷程度，推測二甲雙胍可能對高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細胞發(fā)揮保護作用。

自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)的動態(tài)過程，與胎盤發(fā)育過程中合體滋養(yǎng)層細胞分化調(diào)控相關(guān)。LC3作為最早被發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)記物，其前體產(chǎn)生的LC3Ⅰ與自噬小體結(jié)合形成LC3Ⅱ，是細胞自噬的關(guān)鍵指標(biāo)[11]。P62是自噬底物，參與細胞自噬，與細胞自噬程度呈負相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，二甲雙胍Ⅰ組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組HTR8-SVneo細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值依次降低，p62蛋白表達水平依次升高，提示二甲雙胍能夠抑制高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞自噬水平。紀(jì)璐璐等[13]研究證實，高糖環(huán)境絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的自噬能夠增強凋亡，因此推測二甲雙胍可能通過抑制高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細胞自噬，抑制凋亡，減輕細胞損傷。

Beclin-1、ATG7是自噬相關(guān)蛋白，能夠誘導(dǎo)自噬的形成，研究證實，Beclin-1與ATG7在細胞自噬過程存在相互依賴關(guān)系[14]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，二甲雙胍Ⅰ組、二甲雙胍Ⅱ組及二甲雙胍Ⅲ組Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表達量依次降低，呈劑量依賴性，提示二甲雙胍可能通過Beclin-1/ATG7途徑，抑制高糖誘導(dǎo)的絨毛膜滋養(yǎng)層細胞自噬水平。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，二甲雙胍能夠通過下調(diào)自噬，發(fā)揮高糖條件下的內(nèi)皮保護作用；此外，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及ATG7在非二甲雙胍治療的Ⅱ型糖尿病患者中表達增加，我們推測，二甲雙胍能夠通過抑制高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞過度自噬，發(fā)揮保護作用，該過程可能與Beclin-1/ATG7途徑密切相關(guān)。

綜上所述，二甲雙胍可通過抑制高糖誘導(dǎo)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞自噬，從而減輕高血糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞的損傷，可能與Beclin-1/ATG7途徑有關(guān)，為二甲雙胍用于臨床治療GDM的作用機制提供理論參考。本實驗僅在體外對二甲雙胍的作用機制進行了初步研究，將聯(lián)合體內(nèi)小鼠模型和臨床研究進行更深入的探索。