銀杏二萜內(nèi)酯葡胺對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

彭金亮，熊麗嬌，劉向紅△

腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）損傷是引起腦梗死后遺癥的主要原因，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、自噬、離子通道等有關(guān)，可引起神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［1］。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺（ginkgo diterpene lactone meglumine，GDLM）注射液主要成分為銀杏內(nèi)酯，可治療腦梗死［2］。目前，GDLM 對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的具體作用機(jī)制尚不明確。磷酯酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡等過(guò)程，該通路在腦I-R 損傷中也起著重要作用［3］。多項(xiàng)研究顯示，激活PI3K/AKt/mTOR 信號(hào)通路能夠抑制神經(jīng)元過(guò)度自噬，改善腦I-R 造成的神經(jīng)缺損癥狀［4-5］。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察GDLM 對(duì)腦IR 和氧糖剝奪后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，以期明確其與氧化應(yīng)激和PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SPF 級(jí)6 周齡SD 大鼠30 只，體質(zhì)量180～200 g；孕17 d SD大鼠10只，體質(zhì)量226～275 g，購(gòu)自北京維通利華公司；所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫23 ℃，晝夜節(jié)律光照（12 h∶12 h明暗）環(huán)境，自由進(jìn)食。GDLM購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20120024）。TUNEL 凋亡試劑盒（C1086）購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。尼氏染色試劑盒（DK0022）購(gòu)自北京雷根生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、neurobasal 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清、B27 培養(yǎng)基添加劑、胰酶、青霉素及鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。MTT、多聚-L-賴(lài)氨酸、二甲基亞砜（DMSO）及牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。Neurofilament、PI3K、磷酸化AKt（pAKt）及mTOR 多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。β-actin多克隆鼠源一抗、羊抗兔及羊抗鼠二抗購(gòu)自中杉金橋有限公司。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 大鼠分組及處理 30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組、I-R 組和GDLM 組，每組10只。Sham 組大鼠暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，但不插入栓線。GDLM 組及I-R 組建立腦I-R 模型。GDLM 組在建模后于尾靜脈注射GDLM 注射液（10 mg/kg，1 次/d），Sham 組和I-R組給予等劑量生理鹽水注射。3組大鼠均于術(shù)后72 h處死并采集腦組織。

1.2.2 大鼠腦I-R 模型建立 參照文獻(xiàn)［6］，GDLM 組及I-R組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰位固定，切開(kāi)皮膚，分離右頸總動(dòng)脈、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，并在頸總動(dòng)脈靠近分叉處預(yù)留線，動(dòng)脈夾夾閉分叉處，在頸總動(dòng)脈靠近交叉口處剪一小口，將栓線向頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入，插入深度約18 mm，有明顯阻力時(shí)表明栓線已造成右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞，2 h后拔出栓線，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng)，實(shí)現(xiàn)再灌注，建立大鼠I-R模型，若再灌注順利則模型建立成功?？p合切口，皮膚消毒，抗生素預(yù)防感染。2組均成功建立I-R模型。

1.2.3 腦組織TTC 染色 每組大鼠隨機(jī)抽取4 只取腦，置于腦模，沿大腦的冠狀面切成約2 mm 厚的腦片7 片，前后2 片丟棄，留中間5片，放入預(yù)熱的TTC溶液中，37 ℃避光染色15 min，中途翻面以便著色均勻，腦片取出后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗1 遍，4%多聚甲醛固定液（PFA）固定4～6 h。拍照觀察，Image J 軟件測(cè)算腦梗死體積（%）=梗死體積/總體積×100%。

1.2.4 尼氏染色觀察3組大鼠海馬形態(tài)的變化 3組大鼠均于干預(yù)72 h 后隨機(jī)抽取3 只取腦內(nèi)海馬組織，進(jìn)行-20 ℃低溫冰凍切片，厚度為4 μm，晾干行尼氏染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下（×50或×200）觀察形態(tài)變化。

1.2.5 TUNEL 染色觀察3 組大鼠海馬組織凋亡情 況 3 組大鼠干預(yù)72 h 后隨機(jī)抽取3 只取海馬組織，-20 ℃低溫切片厚度4 μm后4%多聚甲醛固定，PBS清洗，TritonX-100通透，按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL 染色，使用蛋白酶K 進(jìn)行消化，PBS 洗滌2 次，滴入TUNEL 反應(yīng)液及復(fù)合液，使用DAB 顯色，經(jīng)蘇木素染色，封片后觀察。隨機(jī)抽取大鼠海馬CA3區(qū)的組織切片5張，每張隨機(jī)讀取5個(gè)視野，染色呈現(xiàn)為棕褐色的細(xì)胞為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%）＝視野內(nèi)棕色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 Bradford 法定量測(cè)定3 組海馬氧化應(yīng)激指標(biāo) 3 組大鼠干預(yù)72 h 后，隨機(jī)抽取3 只分離海馬組織并剪碎后按1∶9的體積比加入4 ℃生理鹽水成組織勻漿。參照蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣品取20 μg蛋白檢測(cè)MDA含量、GSH-PX和SOD活性的變化。

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.3.1 胎鼠原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 原代海馬神經(jīng)元取自10 只孕17 d SD 大鼠胚胎，胎鼠海馬組織用解剖顯微鏡解剖后放入Hank’s 解剖液中。取部分海馬組織，剪碎后加入0.125%胰酶37 ℃水浴18 min，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打，以1×105/mL 的密度種植于多聚-L-賴(lài)氨酸（0.1 g/L）包被后的培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［7］。培養(yǎng)液中加入100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、10%胎牛血清和10%馬血清。24 h后全量換液，更換為neurobasal+B27 無(wú)血清培養(yǎng)體系，以后每3 d 半量換液。神經(jīng)元第7天時(shí)成長(zhǎng)成熟，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［7］。

1.3.2 胎鼠原代海馬神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)分組 胎鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d 后等量分為對(duì)照（Con）組、氧糖剝奪復(fù)氧模型（oxygen and glucose deprivation/ reoxygenation，OGD/R）組及GDLM 組。對(duì)OGD/R 組和GDLM 組行氧糖剝奪復(fù)氧復(fù)糖處理，Con 組不作處理。GDLM 組處理前每孔加入培養(yǎng)液稀釋10 倍的GDLM 注射液20 μL，培養(yǎng)液終含量為10 ng/L，對(duì)照組和OGD/R組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3.3 胎鼠原代海馬神經(jīng)元OGD/R 處理 吸取OGD/R 組和GDLM 組神經(jīng)元的培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞3 次，換成無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基。在95%N2、5%CO2、100%濕度，37 ℃的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)皿，棄去無(wú)糖培養(yǎng)基，換用正常培養(yǎng)基于5%CO2、95%空氣、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.4 MTT染色觀察3組海馬神經(jīng)元活性變化 3組細(xì)胞每孔加入0.5 g/L的MTT 20 μL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀于570 nm 處測(cè)光密度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對(duì)照組OD平均值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 TUNEL 染色觀察3 組海馬神經(jīng)元凋亡 海馬神經(jīng)元以5×105/L 密度接種于24 孔板，孔底放置已包被多聚-L-賴(lài)氨酸的蓋玻片，進(jìn)行藥物處理和氧糖剝奪處理。PBS洗滌神經(jīng)元3 次，每次2 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3次，每次2 min；0.3%TritonX-100處理15 min，PBS 洗滌3次，每次2 min；參照TUNEL 染色試劑盒說(shuō)明滴加相關(guān)試劑，37 ℃溫箱孵育2 h，PBS洗滌3次，每次2 min；3%牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min；加入Neurofilament 抗體（1∶800），4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜；PBS 洗滌3 次，每次2 min，加二抗（1∶500）37 ℃避光孵育90 min；PBS 洗滌3 次，每次2 min；甘油封片，熒光顯微鏡（×200）下觀察并采集圖像。每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)20 個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Neurofilament 陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3 組海馬神經(jīng)元凋亡 海馬神經(jīng)元以5×105/L 接種于6 孔板，處理方式同1.3.1 ，并加入完全培養(yǎng)液重懸，根據(jù)Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒說(shuō)明操作，加入5 μL Annexin V-FITC，避光1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入緩沖液重懸，加入10 μL的PI染色液充分混合后于4 ℃的恒溫箱中避光染色15 min后于30 min內(nèi)完成檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 Western blot 測(cè)定3 組海馬神經(jīng)元細(xì)胞PI3K、pAKt 及mTOR蛋白的表達(dá) 體外原代胎鼠海馬神經(jīng)元接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，經(jīng)過(guò)藥物及氧糖剝奪處理后收集細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，Bradford 法定量蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，PI3K（1∶500）、pAKt（1∶500）、mTOR（1∶800）多克隆一抗和βactin（1∶1 000）多克隆一抗稀釋于0.5%BSA 液中，與印跡膜室溫孵育2 h，取出用TBST 洗膜10 min×3 次，0.5%BSA 液稀釋的二抗（1∶500）與印跡膜于室溫孵育2 h 后，TBST 液洗膜15 min×3 次，ECL 試劑發(fā)光，凝膠成像儀觀察成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 3 組腦I-R 后梗死體積及凋亡率比較 I-R組大鼠腦梗死體積和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較Sham組均明顯升高，而GDLM 組較I-R 組腦梗死體積減小，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，但仍均高于Sham 組（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2，表1。

Fig.1 Changes of the volume of cerebral infarction in three groups(TTC staining)圖1 3組大鼠腦梗死體積變化（TTC染色）

2.1.2 3組大鼠海馬組織形態(tài)變化 Sham組大鼠海馬CA3 神經(jīng)元形態(tài)正常，排列規(guī)律，層次分明，包膜完整，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，未見(jiàn)細(xì)胞壞死。I-R組大鼠海馬神經(jīng)元層次變少，細(xì)胞萎縮、排列稀疏，部分空泡狀，胞核變小，部分細(xì)胞核固縮、深染，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂不規(guī)律，壞死神經(jīng)元明顯增多。GDLM組海馬神經(jīng)元層次豐富，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，壞死細(xì)胞較少，較I-R 模型組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改善顯著，見(jiàn)圖3。

Fig.2 Hippocampal apoptosis of rats in each group（TUNEL staining,×200圖2 各組大鼠海馬凋亡情況（TUNEL染色，×200）

Fig.3 Morphological changes of hippocampal tissue observed in three groups(Nissl's staining)圖3 各組大鼠海馬組織形態(tài)變化（尼氏染色）

Fig.4 The comparison of apoptosis of hippocampal neurons in primary fetal rats between three groups(TUNEL staining，×200)圖4 各組原代胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況比較（TUNEL染色，×200）

Tab.1 Comparison of the infarction size and hippocampal neuron apoptosis rate in three groups表1 3組I-R 后梗死體積和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）

Tab.1 Comparison of the infarction size and hippocampal neuron apoptosis rate in three groups表1 3組I-R 后梗死體積和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I-R組比較，P＜0.05

組別Sham組I-R組GDLM組F n14 4 4梗死體積（%）2.61±0.96 39.07±7.62a 18.91±2.37ab 62.017＊＊n23 3 3凋亡率（%）1.94±0.32 46.43±1.26a 18.33±0.66ab 63.237＊＊

2.1.3 3 組大鼠海馬組織MDA 含量及SOD、GSHPX 活性比較 與Sham 組比較，I-R 組和GDLM 組MDA 表達(dá)水平較高，SOD 和GSH-PX 活性降低（P＜0.05）；與I-R 組比較，GDLM 組MDA 表達(dá)水平降低，SOD和GSH-PX活性升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of MDA,SOD and GSH-PX changes between three groups of rats表2 各組大鼠MDA、SOD、GSH-PX變化的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of MDA,SOD and GSH-PX changes between three groups of rats表2 各組大鼠MDA、SOD、GSH-PX變化的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與I-R組比較，P＜0.05

組別Sham組I-R組GDLM組F MDA（μmol/g）1.96±0.38 2.84±0.06a 2.13±0.16ab 18.688＊＊SOD（U/mg）267.18±15.13 112.82±10.65a 212.67±6.96ab 235.192＊＊GSH-PX（U/mg）204.78±17.78 125.95±10.78a 185.72±14.6ab 39.271＊＊

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 3組原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元存活率及凋亡率比較 與Con 組比較，OGD/R 組和GDLM 組海馬神經(jīng)元存活率降低，而凋亡率升高（P＜0.05）；與OGD/R組比較，GDLM組海馬神經(jīng)元存活率升高，而凋亡率降低（P＜0.05），見(jiàn)表3，圖4、5。

Tab.3 Comparison of survival rate and apoptosis rate of hippocampal neurons between three groups表3 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率和凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of survival rate and apoptosis rate of hippocampal neurons between three groups表3 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率和凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與OGD/R組比較，P＜0.05

組別Con組OGD/R組GDLM組F存活率100.00±0.06 51.69±12.71a 86.50±3.44ab 64.418＊＊凋亡率TUNEL染色2.77±1.03 44.97±1.56a 27.5±5.55ab 235.755＊＊Annexin V-FITC/PI流式5.14±1.06 47.36±3.90a 26.7±1.82ab 408.238＊＊

2.2.2 3 組細(xì)胞PI3K、pAKt 和mTOR 蛋白表達(dá)情況比 較 Con 組、OGD/R 組、GDLM 組PI3K、pAKt、mTOR的表達(dá)水平依次升高（P＜0.05），見(jiàn)圖6、表4。

3 討論

Fig.5 Effects of GDLM on the apoptosis rate of hippocampal neurons in OGD/R primary fetal rats detected by Annexin V-FITC/PI flow cytometer圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GDLM對(duì)體外OGD/R原代胎鼠海馬神經(jīng)元凋亡率的影響

Fig.6 Comparison of expressions of PI3K,pAKt and mTOR proteins between three groups圖6 3組細(xì)胞PI3K、pAKt和mTOR蛋白表達(dá)情況比較

Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K,pAKt and mTOR between three groups表4 3組細(xì)胞PI3K、pAKt和mTOR蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K,pAKt and mTOR between three groups表4 3組細(xì)胞PI3K、pAKt和mTOR蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與OGD/R組比較，P＜0.05

組別Con組OGD/R組GDLM組F PI3K 0.436±0.013 0.565±0.033a 0.752±0.081ab 29.347＊＊pAKt 0.659±0.043 0.798±0.050a 0.993±0.073ab 26.598＊＊mTOR 0.753±0.018 0.916±0.104a 1.093±0.076ab 15.221＊＊

腦I-R 損傷是腦部血液供應(yīng)被阻斷后，再次恢復(fù)血液灌流后引起的腦損傷。目前，腦I-R 損傷機(jī)制尚不完全清楚，可能與腦部血供中斷引起腦組織缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)、氧自由基增多、細(xì)胞凋亡加重，而恢復(fù)血供后出現(xiàn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧自由基激增、神經(jīng)元凋亡加重等有關(guān)［8］。研究顯示，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能是減輕腦I-R 損傷的有效途徑［9］。

GDLM 可用于腦梗死的治療，其具體作用機(jī)制尚不明確［10］。研究顯示，銀杏內(nèi)酯對(duì)腦I-R 損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)激活核因子2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythreid 2-related factor 2，Nrf2）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）實(shí)現(xiàn)［11］。GDLM 可修復(fù)血腦屏障，減少腦脊液興奮性氨基酸，減輕急性腦梗死大鼠的神經(jīng)缺損癥狀［12-13］。本研究中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，GDLM 能夠減少腦I-R 損傷模型大鼠的腦梗死體積，抑制海馬神經(jīng)元的凋亡；體外實(shí)驗(yàn)顯示，GDLM能夠減少胎鼠海馬神經(jīng)元OGD/R 后的凋亡率，提高存活率，提示GDLM能夠改善腦I-R大鼠神經(jīng)損傷，有神經(jīng)保護(hù)作用，考慮原因與其改善氧化應(yīng)激及減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞存活和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［1］。研究顯示，PI3K/AKt/mTOR 信號(hào)通路具有雙向調(diào)控作用，在神經(jīng)細(xì)胞中AKt 激活可抑制PI3K/AKt/mTOR 信號(hào)通路，激活凋亡信號(hào)分子，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［14］。PI3K被激活后可促進(jìn)AKt 磷酸化，pAKt 可以通過(guò)磷酸化Bad、Caspase 及核因子（NF）-κB 等來(lái)抑制細(xì)胞凋亡［15］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKt/mTOR 信號(hào)通路各成分表達(dá)水平的上調(diào)可調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［16］。上調(diào)PI3K/AKt信號(hào)通路可降低Caspase-3 和BAX 的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬，減少I(mǎi)-R 的神經(jīng)功能缺損，降低腦梗死體積［16-17］。褪黑素可通過(guò)上調(diào)PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路活性，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)［18］。在面神經(jīng)受損［19］、腦外傷［20］和腦I-R 損傷［21］中，激活PI3K/AKt 信號(hào)通路能夠修復(fù)患者的神經(jīng)功能和記憶損傷。加巴噴丁可通過(guò)激活PI3K/AKt/mTOR 信號(hào)通路，抑制大鼠腦I-R 損傷神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自噬，對(duì)腦I-R 損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用［4］。淫羊藿苷可通過(guò)激活PI3K/AKt信號(hào)通路，抑制脊髓損傷大鼠模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減少大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡［5］。目前，雖有研究表明，GDLM 能夠抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)［22］，但鮮見(jiàn)GDLM 與PI3K/mTOR 通路的相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，GDLM 能夠降低腦I-R 損傷大鼠海馬的MDA 表達(dá)水平，提高SOD和GSH-PX活性，同時(shí)能夠上調(diào)海馬神經(jīng)元OGD/R后PI3K、AKt和mTOR的表達(dá)水平，表明GDLM能夠抑制大鼠腦I-R損傷后海馬組織的氧化應(yīng)激，激活PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路。

綜上所述，本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞水平同時(shí)表明，GDLM 能夠抑制腦I-R 損傷和氧糖剝奪復(fù)氧后海馬神經(jīng)元的凋亡，具備神經(jīng)保護(hù)作用，考慮該機(jī)制可能與調(diào)整PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路和影響氧化應(yīng)激有關(guān)。