纖維蛋白粘合劑與人角膜成纖維細(xì)胞的生物相容性

葉青 蔣林志 陳文琳 張煒 曾靜

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021

角膜病是中國(guó)僅次于白內(nèi)障的第二大致盲眼病，各種生物或理化因素均可引起角膜損傷、潰瘍及穿孔，嚴(yán)重影響患者的視功能。周邊板層角膜移植或深板層角膜移植是角膜盲的主要治療手段，但角膜供體來(lái)源不足一直是亟待解決的問題。角膜的供體來(lái)源大致可分為天然生物材料和組織工程角膜材料，天然生物材料包括異體角膜、羊膜、脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)等[1]，組織工程角膜是將體外擴(kuò)增的種子細(xì)胞種植于支架材料上，三維構(gòu)建的角膜類似物。隨著全飛秒激光小切口透鏡取出術(shù)(small incision lenticule extraction，SMILE)的興起，有學(xué)者開始采用SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡修補(bǔ)角膜潰瘍及穿孔，或利用角膜基質(zhì)透鏡構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)支架。由于單層角膜基質(zhì)透鏡中央厚度僅為60～150 μm，縫合時(shí)容易扭曲、脫位，且在修補(bǔ)較大角膜穿孔時(shí)單層透鏡難以承受眼壓，因此可用纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)將多層角膜基質(zhì)透鏡粘合后疊加使用。盡管FS已在國(guó)外眼科臨床廣泛應(yīng)用，但對(duì)其細(xì)胞毒性作用的研究鮮有報(bào)道。本研究從細(xì)胞的形態(tài)、增生及凋亡3個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)FS與人角膜成纖維細(xì)胞(human corneal fibroblasts，HCFs)的生物相容性，以期為FS的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及儀器 FS(上海萊士血液制品股份有限公司)；Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；吖啶橙(acridine orange，AO)/溴化乙錠(ethidium bromide，EB)雙染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。Spark10M型酶標(biāo)分析儀(美國(guó)Thermo公司)；Ti2-U熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Cyto FLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.1.2組織來(lái)源 人角膜基質(zhì)組織取自2018年3—4月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科行SMILE的患者12例24眼，其中男5例，女7例；年齡19～27歲。排除有圓錐角膜、眼部炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病等患者。組織從供體取下至分離培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)1 h。所有患者手術(shù)前均簽署知情同意書且通過(guò)血液傳染病學(xué)檢查。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[批文號(hào)：(醫(yī)倫)快審2018第(022)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1HCFs的體外分離及培養(yǎng) 將角膜基質(zhì)組織用磷酸鹽緩沖液沖洗2～3遍，置于1.5 g/L Ⅰ型膠原酶溶液中37 ℃消化2～3 h，離心半徑16 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將細(xì)胞稀釋后接種于培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中，靜置24 h后全量換液，以后2～3 d換液1次，約7 d后按1∶ 3接種傳代?？紤]到細(xì)胞的穩(wěn)定性及活性，僅選用第2代和第3代細(xì)胞。

1.2.2FS浸提液的配置 37 ℃預(yù)熱裝有凍干纖維蛋白原粉末的產(chǎn)品瓶與2 ml滅菌注射用水，將二者混合為纖維蛋白原溶液(A液)。室溫下將2 ml氯化鈣溶液注射入裝有凍干人凝血酶的產(chǎn)品瓶中，混合制成溶液(B液)。取20 μl A液與20 μl B液混合，使其凝固，加入15 ml完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱中72 h，制成1倍浸提液。取40 μl A液與40 μl B液用上述方法混合制成2倍浸提液。

1.2.3FS與HCFs的復(fù)合培養(yǎng) 在96孔板中加入5 μl A液和5 μl B液，靜置10 s凝固后，將HCFs懸液以6 000個(gè)/孔的密度均勻接種于孔底，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.4MTT法檢測(cè)HCFs的生存率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCFs以3 000個(gè)/孔的密度均勻接種于96孔板，37 ℃靜置24 h，棄去每孔培養(yǎng)液，按照MTT試劑盒的說(shuō)明將細(xì)胞分為3個(gè)組：2倍浸提液組細(xì)胞每孔加入2倍浸提液100 μl；正常對(duì)照組細(xì)胞每孔加入100 μl完全培養(yǎng)基；空白對(duì)照組無(wú)細(xì)胞，每孔加入100 μl完全培養(yǎng)基。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并于換液后24、36、48、60、72 h檢測(cè)各組在波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)生存率(relative growth rate，RGR)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞RGR(%)=(2倍浸提液組平均A值-空白對(duì)照組平均A值)/(正常對(duì)照組平均A值-空白對(duì)照組平均A值)×100%。細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。按照美國(guó)藥典的毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，RGR≥80%即可認(rèn)為材料無(wú)毒。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)Table 1 Cytotoxicity grading等級(jí)RGR(%)細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞增生能力毒性作用0≥100細(xì)胞形態(tài)完整,貼壁良好,無(wú)細(xì)胞溶解優(yōu)-1 80-99 <20%的細(xì)胞呈圓形,貼壁松散,無(wú)胞漿顆粒,偶見細(xì)胞溶解優(yōu) - 2 50-79 20%-49%的細(xì)胞呈圓形,無(wú)胞漿顆粒,可見明顯細(xì)胞溶解良 + 330-4950%-69%的細(xì)胞呈圓形或溶解中++40-29≥70%細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整差+++ 注:RGR:相對(duì)生存率 Note:RGR:relative growth rate

1.2.5HCFs細(xì)胞核AO/EB染色觀察細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCFs，以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為2倍浸提液組和正常對(duì)照組，分別與2倍浸提液和完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)。48 h后每孔依次加入AO染液(終質(zhì)量濃度為2 μg/ml)和EB染液(終質(zhì)量濃度為2 μg/ml)，室溫下避光放置5 min，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的染色情況。AO能透過(guò)完整細(xì)胞膜使細(xì)胞核呈綠色熒光，EB使受損細(xì)胞的細(xì)胞核呈橙紅色熒光，正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光，晚期凋亡和死亡細(xì)胞核呈現(xiàn)橙紅色熒光。

1.2.6流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCFs，以1.2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板上，于培養(yǎng)箱中靜置24 h，棄去每孔培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為1倍浸提液組、2倍浸提液組和正常對(duì)照組，分別用1倍浸提液、2倍浸提液和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，待細(xì)胞鋪滿孔底70%～80%時(shí)，收集每孔細(xì)胞，并按照試劑盒的說(shuō)明，依次加入結(jié)合緩沖液、Annexin-FITC和PI避光染色10～20 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)W檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊，正常對(duì)照組、1倍浸提液組和2倍浸提液組細(xì)胞凋亡率的總體比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCFs的形態(tài)特征

接種后24 h，部分原代HCFs已貼壁，約48 h后可見HCFs伸展為長(zhǎng)梭形或三角形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，核仁清晰，貼壁緊密，排列整齊，呈漩渦狀生長(zhǎng)(圖1A)。

2.2 FS與HCFs復(fù)合培養(yǎng)

接種后48 h，HCFs附著于FS表面生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，排列整齊，核仁清晰(圖1B)。

圖1 HCFs的形態(tài)特征(×200) A：原代培養(yǎng)的HCFs呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，核仁清晰，貼壁緊密，排列整齊，呈漩渦狀生長(zhǎng) B：HCFs與FS復(fù)合培養(yǎng)后48 h，HCFs附著于FS底部生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，排列整齊，核仁清晰(箭頭)。FS凝固時(shí)吸收了部分培養(yǎng)基，故呈現(xiàn)出培養(yǎng)基的顏色Figure 1 Morphological characteristics of HCFs(×200) A:Primary cultured HCFs were spindle-shaped or fusiform with clear nucleoli,close adherence to the culture medium,neat arrangement and grew in spiral B:After 48 hours of co-culture with FS,HCFs adhered to the bottom of FS and grew in normal spindle-shaped or fusiform,with neat arrangement and clear nucleoli (arrow).FS absorbed part of the culture medium when it solidified,so it showed the color of the culture medium

2.3 各組細(xì)胞生存率比較

倒置相差顯微鏡下觀察可見2倍浸提液組和正常對(duì)照組均具有正常的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁良好且形態(tài)完整，無(wú)胞漿顆粒。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，0～72 h內(nèi)2倍浸提液組和正常對(duì)照組細(xì)胞具有相似的增生趨勢(shì)(圖2)。2倍浸提液組36～48 h細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0級(jí)，24 h內(nèi)及60～72 h細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，0～72 h細(xì)胞RGR均>90%(表2)。

圖2 HCFs在FS作用下的生長(zhǎng)曲線 0～72 h內(nèi)2倍浸提液組和正常對(duì)照組細(xì)胞具有相似的增生趨勢(shì)Figure 2 The growth curve of HCFs under the action of FS It showed that the cells in the 2-fold leaching solution group and the normal control group had a similar proliferation trend within 0-72 hours

表2 2個(gè)組細(xì)胞在不同時(shí)間段的A值及細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)Table 2 Absorbance value and cytotoxicity grading in each group at different time points培養(yǎng)時(shí)間(h)樣本量2倍浸提液組(mean±SD)正常對(duì)照組(mean±SD)RGR(%)評(píng)級(jí)(級(jí))細(xì)胞毒性24150.513±0.0470.524±0.08097.801-36150.723±0.0560.662±0.057109.420-48150.880±0.1020.844±0.107104.570-60150.946±0.0981.040±0.07591.041-72151.109±0.0551.204±0.34392.131- 注:RGR:相對(duì)生存率;-:無(wú)毒性 Note:RGR:relative growth rate;-:nontoxicity

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況比較

熒光顯微鏡下可見，2倍浸提液組和正常對(duì)照組均可見大量核染色質(zhì)著綠色的活細(xì)胞，僅有極少量著黃綠色的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的核固縮、核染色增強(qiáng)，還可見有膜包裹的凋亡小體芽生突出于細(xì)胞表面。(圖3)。

圖3 熒光顯微鏡下2個(gè)組細(xì)胞凋亡情況比較(AO/EB，標(biāo)尺=200 μm) 2倍浸提液組和正常對(duì)照組均可見大量核染色質(zhì)著綠色的活細(xì)胞，僅有極少量著黃綠色的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的核固縮、核染色增強(qiáng)，還可見有膜包裹的凋亡小體芽生突出于細(xì)胞表面 A：2倍浸提液組 B：正常對(duì)照組Figure 3 Comparison of apoptosis between the two groups under fluorescence microscope(AO/EB,bar=200 μm) A large number of living cells with green chromatin and only a small number of apoptotic cells with yellow-green nuclear chromatin were found in the 2-fold leaching solution group and the normal control group.The nuclei of the apoptotic cells was pyknotic,the nuclear staining was enhanced,and apoptotic bodies wrapped in membrane protruded outside the cell surface A:2-fold leaching solution group B:normal control group

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、1倍浸提液組和2倍浸提液組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.96±1.09)%、(3.66±1.35)%和(2.88±0.66)%，3個(gè)組細(xì)胞凋亡率總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.89，P=0.13)(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3個(gè)組細(xì)胞的凋亡率 A：正常對(duì)照組流式細(xì)胞圖 B：1倍浸提液組流式細(xì)胞圖 C：2倍浸提液組流式細(xì)胞圖 D：3個(gè)組細(xì)胞凋亡率比較，F(xiàn)=2.89，P=0.13(單因素方差分析，n=9)Figure 4 Cell apoptosis rates of three groups detected by flow cytometry A:Flow cytometry result of the normal control group B:Flow cytometry result of the 1-fold leaching solution group C:Flow cytometry result of the 2-fold leaching solution group D:Quantitative comparison of cell apoptosis rates among the three groups,F=2.89，P=0.13 (One-way ANOVA,n=9)

3 討論

FS在國(guó)內(nèi)尚處于臨床試驗(yàn)階段，但在國(guó)外眼科臨床已廣泛應(yīng)用[2]。FS在翼狀胬肉手術(shù)中的應(yīng)用已超過(guò)30年，大量臨床研究表明用FS代替縫線固定羊膜或其他結(jié)膜移植物能縮短手術(shù)時(shí)間，減輕術(shù)后不適感，并且能有效減少翼狀胬肉復(fù)發(fā)[3]；V?lim?ki[4]使用FS封閉11眼青光眼引流閥植入術(shù)后滲漏，結(jié)果顯示9眼的眼壓從35 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)下降至22 mmHg及以下，并長(zhǎng)期維持穩(wěn)定；一些學(xué)者用FS輔助治療視盤凹陷相關(guān)黃斑脫離，術(shù)后患者未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，且視網(wǎng)膜下積液減輕，治療效果可持續(xù)14個(gè)月[5-6]；將FS應(yīng)用于飛秒激光輔助的準(zhǔn)分子激光角膜原位磨鑲術(shù)，可有效減少角膜上皮向內(nèi)生長(zhǎng)的發(fā)生[7]；將FS應(yīng)用于白內(nèi)障手術(shù)中封閉鞏膜切口，能減少創(chuàng)面滲漏和發(fā)生眼內(nèi)炎的風(fēng)險(xiǎn)[8]。此外，臨床研究表明FS對(duì)角膜潰瘍及穿孔也有很好的治療效果；Sharma等[9]認(rèn)為與其他類型的組織粘合劑比較，F(xiàn)S在修補(bǔ)直徑3 mm以下的角膜穿孔時(shí)，不僅術(shù)后愈合時(shí)間更短，而且角膜新生血管更少，并且對(duì)于直徑3 mm以上的角膜穿孔，也可用FS粘貼羊膜等植片進(jìn)行修補(bǔ)，這提示無(wú)論直徑3 mm以下的小穿孔，還是直徑3 mm以上的大穿孔，使用FS進(jìn)行修補(bǔ)均是一種安全、有效的治療方式。

角膜移植術(shù)是角膜病重要的復(fù)明及治療手段，傳統(tǒng)角膜移植的供體多為遺體捐獻(xiàn)，來(lái)源匱乏，如何擴(kuò)增角膜供體來(lái)源一直是臨床亟待解決的問題。隨著SMILE的興起，術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡逐漸被嘗試應(yīng)用于角膜潰瘍和穿孔的治療。Jiang等[10]采用角膜基質(zhì)透鏡對(duì)14例角膜潰瘍和6例角膜穿孔進(jìn)行修補(bǔ)，術(shù)后角膜損傷愈合良好；Abd Elaziz等[11]采用角膜基質(zhì)透鏡聯(lián)合單層羊膜覆蓋技術(shù)修補(bǔ)7例角膜穿孔，術(shù)后前房形成良好；臨床研究提示，角膜基質(zhì)透鏡可用于緊急情況下角膜穿孔的修補(bǔ)。

隨著此類研究的深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)縫合方法相比，用FS將角膜基質(zhì)透鏡固定在損傷角膜表面，不僅操作簡(jiǎn)便，而且可以減少縫合對(duì)角膜組織的刺激。Bhandari等[12]采用FS將單層角膜基質(zhì)透鏡粘合在7例角膜小穿孔、角膜撕裂及角膜缺損的角膜表面，術(shù)后植片透明且角膜愈合良好。但是由于單層角膜基質(zhì)透鏡的中央厚度僅約為100 μm，在治療較大、較深的角膜潰瘍或穿孔時(shí)，無(wú)論采用縫合還是粘合的方式，單層透鏡均難以承受眼壓，植片可能發(fā)生扭曲、滑動(dòng)，甚至脫落，因此需將多層角膜基質(zhì)透鏡疊加使用，而FS即為良好的粘合疊加方式。Yin等[13]采用FS粘合雙層角膜基質(zhì)透鏡構(gòu)建角膜植片用于兔的前板層角膜移植，術(shù)后角膜完成上皮化且植片透明。此類研究提示，對(duì)于較大、較深的角膜穿孔，用FS粘合多層角膜基質(zhì)透鏡作為植片可能是一種安全、有效的修補(bǔ)手段。

此外，有學(xué)者設(shè)想可采用FS層間粘合多層角膜基質(zhì)透鏡建立具有一定厚度和強(qiáng)度的角膜基質(zhì)支架，聯(lián)合不同的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜，作為角膜移植術(shù)的供體使用，Yin等[13]采用FS粘合多層角膜基質(zhì)透鏡聯(lián)合人角膜緣上皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜，結(jié)果表明該種組織工程角膜與正常的角膜組織具有相似的表型和結(jié)構(gòu)，且FS粘合的多層角膜基質(zhì)透鏡支架足以維持角膜上皮細(xì)胞的黏附、增生和復(fù)層結(jié)構(gòu)的形成。盡管該組織工程角膜尚未在臨床應(yīng)用，但為角膜供體來(lái)源提供了另一種可能。

以往關(guān)于FS的研究多側(cè)重于臨床應(yīng)用方面，對(duì)其生物相容性，尤其是細(xì)胞毒性的研究較少。有學(xué)者認(rèn)為FS粘合雖然可降低手術(shù)難度，但可能存在增加排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要證實(shí)FS是否影響體內(nèi)微環(huán)境。材料對(duì)體內(nèi)微環(huán)境的影響即為材料的生物相容性，即生物材料在宿主特定的環(huán)境和部位，能夠耐受宿主各系統(tǒng)作用而保持相對(duì)穩(wěn)定，不發(fā)生排斥反應(yīng)的特性，包括組織相容性和血液相容性[14]。關(guān)于FS的血液相容性，有研究表明FS經(jīng)腹腔內(nèi)注射不會(huì)影響大鼠的凝血時(shí)間和凝血酶活性[15]；同時(shí)也有研究表明連續(xù)14 d給予大鼠腹腔內(nèi)注射FS浸提液，高劑量組較低劑量組凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，臟器系數(shù)明顯升高，這一結(jié)果提示高劑量的FS可能有潛在的免疫毒性，其靶器官為凝血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的脾臟。組織相容性一般通過(guò)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)定，通過(guò)模擬細(xì)胞生存環(huán)境，觀察材料對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增生及代謝的影響。本研究采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO10993(GB/T16886)推薦的MTT法及細(xì)胞膜完整性測(cè)定方法(AO/EB染色法)，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡3個(gè)角度評(píng)估FS對(duì)HCFs的影響。

本研究結(jié)果顯示,AO/EB染色后2倍浸提液組及正常對(duì)照組熒光顯微鏡下均可見大量呈綠色熒光的活細(xì)胞，僅有極少量細(xì)胞呈現(xiàn)早期凋亡的黃綠色熒光，說(shuō)明在FS浸提液中生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)異常凋亡，少量早期凋亡細(xì)胞很可能與細(xì)胞衰老有關(guān)；MTT法證實(shí)2倍浸提液組與正常對(duì)照組具有相似的增生趨勢(shì)，36～48 h浸提液組細(xì)胞生長(zhǎng)速度略高于正常對(duì)照組，說(shuō)明在一定程度上FS可促進(jìn)細(xì)胞增生，這與Krug等[16]及Hopfner等[17]報(bào)道的結(jié)果一致。我們推測(cè)可能是FS的某些成分，如凝血因子ⅩⅢ給細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一定的營(yíng)養(yǎng)支持，刺激細(xì)胞增生；細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)有害因素的自衛(wèi)反應(yīng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)證實(shí)FS并未誘導(dǎo)HCFs凋亡，不同劑量組間細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明FS對(duì)細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。

本研究中采用的HCFs來(lái)源于角膜基質(zhì)組織，是角膜基質(zhì)微環(huán)境成分中重要的調(diào)控細(xì)胞，參與調(diào)控角膜新生血管的形成、炎癥反應(yīng)及修復(fù)過(guò)程[18]。角膜基質(zhì)層約占角膜全層的90%，在一定程度上能模擬體內(nèi)的角膜環(huán)境，適用于研究FS對(duì)角膜的影響。本研究中，考慮到SMILE是直接在角膜基質(zhì)層做預(yù)設(shè)深度的切削，取出的組織僅有角膜基質(zhì)組織，而角膜基質(zhì)組織主要由大量的膠原纖維和成纖維細(xì)胞構(gòu)成，因此用膠原酶Ⅰ消化取出的角膜基質(zhì)組織，將得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行體外培養(yǎng)后，得到的細(xì)胞即是基質(zhì)層來(lái)源的HCFs，因此未做細(xì)胞鑒定。此外，本課題組前期已建立穩(wěn)定的從牛角膜基質(zhì)組織中分離培養(yǎng)HCFs的技術(shù)方法，并對(duì)培養(yǎng)出的HCFs進(jìn)行了細(xì)胞鑒定[19]。本研究參照文獻(xiàn)[19]的方法，并利用了相同型號(hào)的膠原酶、相同的細(xì)胞培養(yǎng)條件等對(duì)人角膜基質(zhì)組織進(jìn)行分離培養(yǎng)。本研究中利用SMILE術(shù)中取出的角膜基質(zhì)組織在體外分離培養(yǎng)HCFs，不僅取材方便、原料充足，而且方法非常簡(jiǎn)便，培養(yǎng)周期短，獲得的細(xì)胞純度很高。由于屈光手術(shù)患者普遍比較年輕，因此獲得的細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞活性和增生能力。由于FS具有一定黏度，在與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)會(huì)粘掉部分已經(jīng)貼壁的細(xì)胞，造成細(xì)胞數(shù)目減少，引起A值降低。為避免這種影響，本研究中采用浸提液法研究FS的細(xì)胞毒性[20]。

本研究從細(xì)胞形態(tài)、增生及凋亡3個(gè)方面證實(shí)在體外環(huán)境下FS與HCFs具有良好的生物相容性，不同濃度的FS對(duì)HCFs的形態(tài)、增生及凋亡均無(wú)顯著影響，但FS是否影響HCFs的細(xì)胞分泌功能仍需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)S無(wú)體外細(xì)胞毒性且與HCFs有良好的生物相容性，為其廣泛應(yīng)用于角膜潰瘍及穿孔的修補(bǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突