BALB/c小鼠單純皰疹病毒性角膜炎復發(fā)感染模型的建立及鑒定

肖書毓 俞瑩 陶津華

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院眼科 201203

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)是臨床常見的致盲眼病，大多數(shù)感染的病毒是Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)，1%～2%的臨床患者最終可致盲[1]。這些致盲病例中大多是因HSV-1潛伏感染重新激活而導致，因此HSK復發(fā)模型的建立對于疾病的研究至關重要。紫外燈照射是常用的誘導HSK復發(fā)的手段，但以往所報道的實驗研究中，研究者多在角膜行病毒接種后腹腔內(nèi)注射中和HSV-1的異種血清抗體，以保證小鼠的存活，但異種抗HSV血清較難獲?。欢矣醒芯勘砻?，不予腹腔內(nèi)注射抗HSV血清會更貼近疾病自然發(fā)生時的機體免疫表現(xiàn)[2]。本研究探討未腹腔內(nèi)注射血清抗體的BALB/c小鼠復發(fā)性HSK模型的建立方法并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 選取健康5周齡BALB/c雌性小鼠84只[上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(No.20180006001983)，許可證號：SCXK(滬)2018-0006]，所有小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(批文號：PZSHUTCM190222039)，動物使用符合美國視覺和眼科研究協(xié)會的動物使用宣言規(guī)定。非洲綠猴腎細胞(Vero)由上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器 HSV-KOS病毒株、DMEM溶液(上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心病毒實驗室提供)；林可霉素滴眼液(上海信誼藥廠有限公司)；熒光素鈉染色試紙(天津晶明新技術開發(fā)有限公司)；戊巴比妥鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司)。裂隙燈顯微鏡(YZ5H1，武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司)；低溫離心機(5810R，德國Eppendorf公司)；酶標儀(T100，美國伯樂公司)；SZM系列體氏顯微鏡(深圳市方特科技有限公司)；手持紫外燈照射儀、紫外照射防護袋(上海熙浩實業(yè)有限公司)；倒置細胞顯微鏡(EVOS M5000，美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組 任取12只小鼠采用隨機數(shù)字表法按照紫外燈照射時間不同分為紫外燈照射3 min組、紫外燈照射2 min 45 s組和紫外燈照射2 min 30 s組，每組4只小鼠，確定最適紫外燈照射參數(shù)。將剩余72只小鼠采用隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組和復發(fā)組，每組24只。

1.2.2紫外燈照射參數(shù)的篩選 右手拇指、食指抓取小鼠雙耳及頸后皮膚，小指固定尾部，使小鼠右眼正面向上。右手固定小鼠后套上紫外照射防護袋，防護袋有直徑0.6 cm小孔使小鼠僅右眼暴露于紫外燈照射下，將手持紫外燈置于距離小鼠右眼上方5 cm處，按照分組進行不同時間的照射。于紫外燈照射后2 min和3 d，采用林可霉素滴眼液浸潤熒光素鈉試紙行小鼠右眼染色，裂隙燈顯微鏡下觀察角膜染色情況并拍照，選擇最佳照射條件。

1.2.3初次感染造模 空白對照組、模型組和復發(fā)組小鼠按照10 ml/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉行全身麻醉。采用文獻[1]描述的方法用醫(yī)用手術刀片在小鼠右眼角膜上皮劃開#字，空白對照組術眼滴入5 μl生理鹽水，模型組和復發(fā)組小鼠術眼滴入HSV-1病毒懸液1×106PFU各5 μl，用無菌棉簽輕輕按摩術眼使病毒懸液充分吸收；麻醉時所有小鼠對側眼均用5 μl生理鹽水點眼以保持眼部濕潤。造模后1 h觀察小鼠的復蘇情況，造模后1～3 d每只小鼠早晚分別用林可霉素滴眼液點眼1次，預防細菌感染，并且所有小鼠不予腹腔內(nèi)注射HSV-1異種血清抗體。HSV-1病毒懸液接種后第3天，用熒光素鈉試紙染色后在裂隙燈顯微鏡下觀察到角膜上皮點狀或樹枝狀缺損，標志初次病毒感染造模成功。然后用DMEM溶液沾濕的無菌棉棒在72只小鼠的右眼上擦拭，將棉棒放入DMEM溶液試管中震蕩，離心半徑15 cm，4 ℃條件下2 000 r/min離心5 min，吸出200 μl上清液放入48孔板的Vero細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察。

1.2.4復發(fā)感染造模 初次感染后5周，裂隙燈顯微鏡下檢查小鼠雙眼角膜，排除HSK的自發(fā)性復發(fā)。然后對復發(fā)組24只小鼠進行紫外燈照射(紫外線B-302 nm)復發(fā)造模處理。給予小鼠右眼2 min 45 s的紫外燈復發(fā)照射，照射劑量為2.104 mJ/cm2，將無菌棉球在紫外燈復發(fā)照射前置于1 ml DMEM培養(yǎng)液中，在紫外燈照射前和照射后1～7 d，每天用無菌棉棒在72只小鼠的右眼上擦拭，將角膜擦拭液相對應地放入48孔板的Vero細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察來確定病毒活化脫落。

1.2.5小鼠眼表病變表現(xiàn)及評價 參照Ando計分法及Trousdale計分法[3-4]，裂隙燈顯微鏡照相和解剖顯微鏡下檢查并評價角膜基質混濁和瞼緣炎的嚴重程度，采用0～4分評分法[1]。(1)角膜基質混濁的評分標準 0分：角膜基質清晰透明；1分：角膜基質稍混濁；2分：角膜基質中度混濁，可透見后部虹膜特征；3分：角膜基質重度混濁不透明，但仍可判斷瞳孔緣的位置；4分：角膜基質完全混濁，不能看到后部特征。(2)瞼緣炎評分標準 0分：無病變；1分：輕度眼瞼腫脹；2分：中度眼瞼腫脹和眼球分泌物；3分：眼瞼嚴重腫脹，中度眼周皮膚脫落和病變；4分：眼瞼嚴重腫脹，嚴重的眼周皮膚脫落和病變。眼表病變總評分=角膜基質混濁程度評分+瞼緣炎評分。

1.2.6復發(fā)性HSK的評判標準及鑒定指標 采用文獻[5]的方法和標準，對紫外燈照射后的角膜擦拭液進行Vero細胞培養(yǎng)，細胞形態(tài)學發(fā)生漂浮、聚攏、變形等改變(cytopathic effect，CPE病變)且角膜熒光染色觀察到角膜深層或淺層病變即可確定為HSK復發(fā)。鑒定指標包括小鼠眼表病變評分、角膜染色病變表現(xiàn)及CPE病變陽性率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad 7.0統(tǒng)計學軟件(序列號：GPS-0320559-LFUL-95242)和Excel軟件進行統(tǒng)計分析。本研究中計量資料經(jīng)W檢驗證實符合正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間均數(shù)經(jīng)Levene檢驗證實方差齊。采用隨機區(qū)組設計，空白對照組、模型組和復發(fā)組小鼠紫外燈照射后不同時間點眼表癥狀評分比較采用重復測量兩因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。模型組與復發(fā)組小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)CPE病變陽性率比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫外燈照射后小鼠角膜表現(xiàn)

紫外燈照射3 min組小鼠照射后2 min角膜染色可見輕度水腫，3 h后水腫消失，照射后3 d角膜染色可見少量色素沉著；紫外燈照射2 min 45 s組小鼠照射后2 min角膜染色可見輕度水腫，3 h后水腫消失，照射后3 d角膜染色未見色素沉著，角膜透明；紫外燈照射2 min 30 s組小鼠照射后2 min角膜無水腫，照射后3 d角膜染色未見色素沉著，角膜透明(圖1)。故選取照射時長2 min 45 s為紫外燈照射最適條件。

圖1 紫外燈照射后不同時間點小鼠角膜染色圖 A：照射后2 min，紫外燈照射3 min組小鼠角膜輕度水腫 B：照射后3 d，紫外燈照射3 min組小鼠角膜可見輕度染色 C：照射后2 min，紫外燈照射2 min 45 s組小鼠角膜輕度水腫 D：照射后3 d，紫外燈照射2 min 45 s組小鼠角膜透明，未見色素沉著 E：照射后2 min，紫外燈照射2 min 30 s組小鼠角膜未見水腫 F：照射后3 d，紫外燈照射2 min 30 s組小鼠角膜透明，未見色素沉著Figure 1 Corneal staining of mice in different groups at different time points after ultraviolet light irradiation A：Two minutes after ultraviolet light irradiation，the 3 minutes group mice showed slight corneal edema B：Three days after ultraviolet light irradiation，a small amount of pigmentation was found in the cornea of 3 minutes group C：Two minutes after ultraviolet light irradiation，the 2 minutes 45 seconds group mice showed slight corneal edema D：Three days after ultraviolet light irradiation，no pigmentation was found，and the cornea was transparent in the 2 minutes 45 seconds group E：Two minutes after ultraviolet light irradiation，no corneal edema was found in the 2 minutes 30 seconds group F：Three days after ultraviolet light irradiation，no pigmentation was found，and the cornea was transparent in the 2 minutes 30 seconds group

2.2 初次病毒感染后和紫外燈照射后小鼠眼表表現(xiàn)

復發(fā)組小鼠初次病毒感染后3 d右眼出現(xiàn)角膜混濁，角膜呈點狀染色，分泌物增多。初次病毒感染后1周，復發(fā)組小鼠右眼角膜逐漸恢復光滑。初次病毒感染后5周，模型組和復發(fā)組小鼠眼瞼輕度腫脹，角膜透明。紫外燈照射后3 d，空白對照組小鼠角膜透明、光滑，復發(fā)組小鼠角膜水腫 、混濁，出現(xiàn)地圖樣或樹枝狀染色(圖2)。復發(fā)組有75%(18/24)的小鼠出現(xiàn)較明顯的眼表感染癥狀。

圖2 初次病毒感染后和紫外燈照射后小鼠角膜染色圖 A：初次病毒感染后3 d復發(fā)組小鼠角膜呈點狀染色 B：紫外燈照射后3 d，空白對照組小鼠角膜光滑、透明 C：紫外燈照射后3 d，復發(fā)組小鼠角膜混濁，呈現(xiàn)地圖樣染色，中度眼周皮膚脫落 D：紫外燈照射后3 d，復發(fā)組小鼠角膜出現(xiàn)樹枝狀染色，輕度眼周皮膚脫落Figure 2 Corneal staining of mice in different groups after ultraviolet light irradiation and initial viral infection A：Three days after the initial viral infection，the cornea of the mice in the recurrence group showed punctate staining B：Three days after ultraviolet light irradiation，the cornea of the mice in the blank control group showed smooth and transparent C：Three days after ultraviolet light irradiation，the cornea of the mice in the recurrence group showed opacity，geographic staining，and moderate periocular skin exfoliation D：Three days after ultraviolet light irradiation，the corneal staining of the mice in the recurrence group showed dendritic staining and mild periocular skin exfoliation

2.3 各組小鼠紫外燈照射后不同時間點眼表病變癥狀評分

紫外燈照射后1 d，復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分較空白對照組小鼠高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)，復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分較模型組小鼠略高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。紫外燈照射后3 d，復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分較空白對照組、模型組小鼠高，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.002、0.003)。紫外燈照射后7 d，復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分較空白對照組小鼠高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)；復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分較模型組小鼠略高，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069)(表1)。

表1 各組小鼠紫外燈照射后不同時間點眼表癥狀評分比較(mean±SD,分)Table 1 Comparison of ocular symptom score among different groups after ultraviolet light irradiation at different time points (mean±SD,score)組別眼數(shù)紫外燈照射后不同時間點眼表癥狀評分0d1d3d7d空白對照組240.167±0.3730.333±0.4710.000±0.0000.167±0.373模型組241.500±0.5001.500±0.7640.833±0.3731.000±0.577復發(fā)組240.833±0.3732.667±0.943a5.167±2.267ab3.000±1.155a 注:F組別=48.84,P<0.01;F時間=5.00,P<0.01.與相應時間點空白對照組比較,aP<0.05;與相應時間點模型組比較,bP<0.05(重復測量兩因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Fgroup=48.84,P<0.01;Ftime=5.00,P<0.01.Compared with the blank control group,aP<0.05;Compared with the model group,bP<0.05(Repeated measurement two-way ANOVA,LSD-t test)

2.4 小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)CPE病變表現(xiàn)

小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)后5 d，復發(fā)組共有17只小鼠角膜擦拭液樣本的細胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE病變，細胞培養(yǎng)液未變色(圖3)，陽性率為71%(17/24)，模型組CPE病變陽性率為8%(2/24)，細胞培養(yǎng)液顏色變黃，復發(fā)組CPE病變陽性率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.601，P=0.001)(表2)。

圖3 小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)CPE病變圖(×200，標尺=200 μm) 空白對照組、模型組和復發(fā)組紫外燈照射前小鼠角膜擦拭液細胞呈長梭形，培養(yǎng)基顏色無變化；紫外燈照射后空白對照組小鼠角膜擦拭液細胞呈長梭形，培養(yǎng)基顏色變黃，模型組小鼠角膜擦拭液細胞形態(tài)部分皺縮、變形，培養(yǎng)基顏色變黃，復發(fā)組小鼠角膜擦拭液細胞形態(tài)呈現(xiàn)皺縮、聚攏改變，培養(yǎng)基顏色無變化Figure 3 CPE lesions of Vero cells cultured in corneal wiping fluid from mice of different groups (×200，bar=200 μm) In the blank control group，model group and recurrence group，the Vero cells was in a long spindle shape，and the color of the medium had no change before ultraviolet light irradiation；in the blank control group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells was in a long spindle shape，and the culture medium turned yellow；in the model group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells was partially shrunk and deformed，and the culture medium turned yellow；in the recurrence group after ultraviolet light irradiation，the Vero cells showed shrunk and gathered，and the color of the medium did not change

表2 模型組與復發(fā)組小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)CPE病變陽性率比較Table 2 Comparison of the number of CPE lesion in Vero cells cultured in corneal wiping fluid between model group and recurrence group組別樣本量CPE病變數(shù)未有CPE病變數(shù)CPE病變陽性率(%)模型組242228復發(fā)組2417771χ2值19.601P值0.001 注:(χ2檢驗) CPE病變:細胞形態(tài)學發(fā)生漂浮、聚攏、變形等改變 Note:(χ2test) CPE lesion:the morphological changes of cells such as floating,agglomeration and deformation occurred

3 討論

HSV-1在世界范圍內(nèi)流行，據(jù)統(tǒng)計約90%的人攜帶該病毒[6-7]。面對如此龐大的感染人群，建立一個可靠的動物模型對于研究疾病潛伏期/再激活、控制復發(fā)的機制和測試治療性疫苗和藥物療效至關重要。HSK的小鼠復發(fā)模型相比其他動物模型更有優(yōu)勢，小鼠復發(fā)模型中的臨床特征可模擬人類疾病中觀察到的許多癥狀[3]。

以往研究中病毒性角膜炎復發(fā)造模時通常會在模型初次感染病毒之后注射人抗HSV血清以中和病毒，減少HSV-1病毒感染后急性眼病引起的小鼠死亡和角膜損傷，保證小鼠的存活[1]。但抗HSV血清獲取困難，增加了造模的不便。有研究顯示臨床上成年人血清抗體陽性率較高，但對疾病診斷和評估意義不大[8]；還有研究顯示免疫血清的注射可能調(diào)節(jié)先天性和獲得性皰疹免疫[2]，我們認為抗體注射改變了病毒感染的自然過程，從而改變再次暴露于病毒抗原(即重新激活的病毒)后對HSV-1的記憶免疫反應。因此，造模過程中避免使用血清抗體能更貼近自然的臨床情況。本研究結果顯示,未給予腹腔內(nèi)抗HSV血清注射不會影響小鼠的存活率，且未對模型后續(xù)的建立和處理造成影響。HSK的病程始于HSV-1的初次感染，隨后是病毒進入感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)節(jié)的潛伏期，復發(fā)的基礎是病毒的潛伏和復發(fā)因素的影響，與是否注入抗HSV血清并無密切關系。

HSK復發(fā)的機制為機體免疫力下降，潛伏的病毒在小鼠模型中激活，沿三叉神經(jīng)逆行至靶組織引起發(fā)病[9]。在小鼠體內(nèi)潛伏感染的HSV-1幾乎不會自發(fā)激活，紫外燈照射法是HSK復發(fā)模型采用的誘導復發(fā)手段之一，此法既會導致淚液中病毒的重新激活和部分脫落，又會導致HSK的復發(fā)[10]。因為該方法相對安全、有效，并且與人感染情況相近，故常規(guī)采用此法。為排除紫外燈照射法對BALB/c小鼠角膜的影響，本研究專門設置了紫外燈照射時間篩選實驗，結果顯示紫外燈照射在適當?shù)臅r間下對于角膜的影響僅是短暫的輕度水腫，照射后3 d角膜染色無異常，眼表損傷恢復。在此研究中確定了紫外燈照射時長為2 min 45 s，相較于其他研究的3 min照射時長更短，可避免照射時紫外燈對于眼表損傷的影響。

本研究中初次病毒感染后3 d，復發(fā)組小鼠右眼角膜出現(xiàn)混濁，角膜呈現(xiàn)點狀染色，標志著復發(fā)組小鼠初次病毒感染成功。紫外燈照射后3 d，角膜呈現(xiàn)地圖狀和樹枝狀染色改變，右眼分泌物增多，部分小鼠出現(xiàn)雙眼同時感染的情況，推測病毒在潛伏時會出現(xiàn)眼位遷移，這也提示我們在臨床上應注意疾病的早期預防，防止遷移發(fā)病。目前大多學者認為HSV-1感染人體后可在三叉神經(jīng)元中潛伏，易形成終生潛伏感染狀態(tài)[11]；也有研究認為，角膜亦可能是病毒潛伏的場所和HSK復發(fā)的另一個潛在根源[12]。觀察感染小鼠角膜擦拭液對細胞生長形態(tài)的影響是鑒定小鼠HSK復發(fā)的一個依據(jù)，在HSV-1的作用下，Vero細胞形態(tài)會發(fā)生CPE病變，這被認為是確認病毒再活化的依據(jù)[1]。在紫外燈照射后，復發(fā)組小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE病變，細胞培養(yǎng)液未變色，顯示細胞因病毒感染未過度生長，培養(yǎng)基營養(yǎng)未耗竭；空白對照組小鼠角膜擦拭液細胞培養(yǎng)未出現(xiàn)CPE病變，因細胞過度生長，培養(yǎng)液營養(yǎng)耗竭，顏色變黃。復發(fā)組較模型組小鼠細胞培養(yǎng)CPE病變陽性率更高，說明誘導HSK復發(fā)建模成功。

此外，并非所有HSV-1潛伏感染的小鼠在紫外燈照射后都會在淚膜中檢測到病毒脫落，但這并不意味著它們不能被成功激活[13]，可能是病毒數(shù)量過低，通過角膜擦拭液的細胞培養(yǎng)無法檢測到。復發(fā)大多會造成角膜基質層的損傷，導致嚴重且反復發(fā)作的臨床表現(xiàn)，包括角膜混濁、新生血管形成等[14]。每天用裂隙燈顯微鏡檢查角膜染色表現(xiàn)，角膜呈現(xiàn)樹枝狀、地圖狀等表現(xiàn)結合眼表病變癥狀評分可幫助評判HSK的復發(fā)。隨著疾病發(fā)展，復發(fā)組小鼠眼表病變癥狀評分逐漸升高，在紫外燈照射后3 d，復發(fā)組小鼠眼部表現(xiàn)明顯，眼表病變癥狀評分最高；紫外燈照射后7 d，眼表病變癥狀評分開始下降；模型組及空白對照組小鼠眼表病變癥狀評分相對較低。紫外燈照射后，眼表的表現(xiàn)和角膜擦拭液細胞培養(yǎng)CPE病變陽性率2個指標結合可鑒定復發(fā)模型的建立是否成功。復發(fā)組小鼠中細胞培養(yǎng)CPE病變陽性率為71%，裂隙燈顯微鏡下觀察復發(fā)組中75%小鼠有眼部表現(xiàn)，部分小鼠有眼表表現(xiàn)而未觀察到細胞的CPE病變，故2個指標綜合計算復發(fā)建模成功率可達71%。此造模方法的免疫學評價還有待進一步研究。

本研究結果顯示紫外燈照射可成功誘導未注射中和血清抗體的HSK小鼠復發(fā)，造模成功率高，制作過程簡便可控，是研究復發(fā)性HSK合適的模型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明肖書毓：實驗操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析；俞瑩：實驗設計和指導、論文修改、經(jīng)費支持；陶津華：文獻查找