WT1基因在監(jiān)測(cè)急性髓細(xì)胞白血病微小殘留病中的臨床意義

許飛，李玲，馬慧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 血液科，寧夏 銀川 750004）

0 引言

急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）是以異常分化的髓系細(xì)胞對(duì)骨髓，血液和其他組織的浸潤(rùn)為特征的血液系統(tǒng)惡性腫[1]。雖然目前AML的完全緩解率（CR）可達(dá)到60%-80%，然而之后仍存在較高的復(fù)發(fā)率。而微小殘留?。∕RD）是AML復(fù)發(fā)的主要原因，MRD 是指AML經(jīng)化療后或骨髓移植后體內(nèi)殘留微量白血病細(xì)胞。準(zhǔn)確動(dòng)態(tài)評(píng)估AML患者治療后的MRD 對(duì)盡早預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、評(píng)價(jià)療效、指導(dǎo)個(gè)體化治療、有效地延長(zhǎng)患者生存期均有重要意義[2]。同時(shí)進(jìn)一步研究MRD特征性分子標(biāo)志對(duì)監(jiān)測(cè)MRD具有重要價(jià)值。WT1基因存在于11p13q染色體，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)參與造血干細(xì)胞正常分化與促進(jìn)細(xì)胞異常過(guò)度增殖兩個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。許多血液系統(tǒng)腫瘤及實(shí)體腫瘤均高表達(dá)WT1基因，特別是在白血病中，WT1基因的表達(dá)被作為白血病細(xì)胞存在的標(biāo)志。同時(shí)，有研究報(bào)道WT1的mRNA表達(dá)水平與白血病疾病活動(dòng)情況密切相關(guān)[3]。因此，本研究進(jìn)一步探討WT1的mRNA水平是否可以作為AML微小殘留病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)及其臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象。2017年 6月至 2019年 6月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液內(nèi)科收治住院64例初發(fā)AML患者。所有AML患者均符合國(guó)際FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞核型和分子生物學(xué)結(jié)果確診。其FAB分型見表1。誘導(dǎo)治療及緩解后治療均參照成人急性髓細(xì)胞白血病診療指南[4]。經(jīng)誘導(dǎo)緩解治療后，其中46例患者達(dá)完全緩解，并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，其中15例患者復(fù)發(fā)。通過(guò)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（MFC）檢測(cè)完全緩解（CR）及每次鞏固化療后 MRD 水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），RT-PCR 檢測(cè)每次鞏固化療后骨髓 WT1 基因表達(dá)水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），同時(shí)檢測(cè)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。此外，所有患者均簽署知情同意書并通過(guò)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 WT1定量檢測(cè)。抽取患者骨髓，用Ficoll分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop 2000分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度，所有樣本符合A260/A280 ≥1.8。取1ug RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并應(yīng)用一步法RT-qPCR WT1試劑盒；反應(yīng)條件：42攝氏度30分鐘，94攝氏度變性5分鐘，94攝氏度變性15秒，60攝氏度退火1分鐘，循環(huán)40次。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7500（美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品）中進(jìn)行，內(nèi)參基因選用ABL基因。

1.3 MFC檢測(cè)MRD。選擇髓系抗原：CyMPO、CD13、CD33、CDw65、CD14、CD15、CD64、CD117等。取1×106個(gè)骨髓細(xì)胞與上述抗體在室溫孵育15分鐘，用氯化銨溶血后加生理鹽水300G 5分鐘離心洗滌一次，棄上清，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，并應(yīng)用Cytomics? FC-500 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。分析 CD45/SS 散點(diǎn)圖的各群細(xì)胞抗原表達(dá)情況，取10000 個(gè)細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算得出表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞之和所占細(xì)胞總數(shù)的百分比。本研究選取閾值為1%，MRD>1%為高水平，≤1%為低水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用 SPSS 23．0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間WT1 mRNA水平比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 64例AML患者的一般資料

2 結(jié)果

2.1 WT1 mRNA水平在AML患者初發(fā)、CR及復(fù)發(fā)期的變化。RT-qPCR證明WT1表達(dá)在初發(fā)AML患者中的表達(dá)明顯高于CR及復(fù)發(fā)期表達(dá)水平（P<0.01），見圖1；在AML各亞型間M3的WT1表達(dá)最高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

2.2 AML患者CR后骨髓MRD與WT1表達(dá)水平的相關(guān)性。對(duì)AML患者CR狀態(tài)的骨髓行MRD及WT1基因表達(dá)水平相關(guān)性分析，結(jié)果提示二者呈正相關(guān)（r=0.47，P<0.01）。

圖1 WT1 mRNA表達(dá)水平在AML初發(fā)患者、完全緩解及復(fù)發(fā)組中的差異

圖2 WT1 mRNA表達(dá)水平在AML患者不同亞型（M1-M6）中的比較

2.3 聯(lián)合動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)AML患者CR后骨髓MRD及WT1表達(dá)水平與AML復(fù)發(fā)的關(guān)系。46例AML患者CR后，骨髓MRD與WT1任一水平增高組20例，復(fù)發(fā)11例（55%）骨髓MRD與WT1均水平降低組18例，復(fù)發(fā)2例（11%），兩者復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

WT1 基因于1990年被學(xué)者Call首次發(fā)現(xiàn)[5]，目前許多研究認(rèn)為 WT1基因具有轉(zhuǎn)錄抑制及激活的雙重作用，其能在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤中的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用[6]。之后的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)WT1特殊的雙向調(diào)控作用也參與了造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并影響其增殖和分化，同時(shí)對(duì)造血細(xì)胞的凋亡也具有重要作用[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道WT1基因在幼稚細(xì)胞中高表達(dá)并抑制分化，具有癌基因特征。有學(xué)者報(bào)道初發(fā)AML患者中高表達(dá)WT1基因提示預(yù)后更差。

本研究發(fā)現(xiàn)，在初發(fā)AML患者中其WT1基因表達(dá)水平明顯高于完全緩解期，且復(fù)發(fā)期較完全緩解也明顯升高，說(shuō)明WT1轉(zhuǎn)錄水平與AML臨床緩解和復(fù)發(fā)有關(guān)，與Marjanovic等學(xué)者報(bào)道結(jié)果一致[8]。在AML各亞型之間，我們發(fā)現(xiàn)M3的WT1表達(dá)水平最高，而M1的表達(dá)水平最低，與YingChan等學(xué)者結(jié)果一致[9]。在進(jìn)行AML患者M(jìn)RD和WT1水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，對(duì)CR 后規(guī)律治療的 46例患者進(jìn)行 MRD及WT1 表達(dá)水平監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn) CR 期間 WT1 表達(dá)增高者復(fù)發(fā)率明顯增高。進(jìn)一步提示W(wǎng)T1基因表達(dá)可以在分子層面作為AML患者M(jìn)RD的一項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。因此應(yīng)用RT-qPCR的方法檢測(cè)WT1基因表達(dá)可作為MRD檢測(cè)及AML疾病復(fù)發(fā)的標(biāo)志，并根據(jù) MRD 及 WT1 表達(dá)水平的變化及時(shí)調(diào)整治療方案，給予有效的干預(yù)，可明顯減低復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。

另一方面由于 WT1 基因在AML患者中高表達(dá)，以其作為治療靶點(diǎn)的基因腫瘤疫苗也逐漸被人們關(guān)注和研究，現(xiàn)已有進(jìn)入臨床試驗(yàn)的相關(guān)腫瘤疫苗[10]，后續(xù)我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證上述結(jié)果，同時(shí)在分子水平探討WT1參與AML的發(fā)生機(jī)制。