黃獨微型塊莖鯊烯合酶的基因克隆與序列分析

柯維忠 鐘雯娟 劉凱盈 李祥媛 尹明華

（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒 334001）

黃獨（Dioscorea bulbifera L.）為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物，在東南亞、大洋洲、非洲和美洲均有分布［1］。黃獨地下塊莖俗稱“黃藥子”，藥用歷史悠久，唐代孫思邈的《千金·月令》曾記載“以萬州黃藥子浸酒可治瘤疾”［2］。據(jù)《中國藥典》（1963）記載：黃藥子性味苦、辛涼，有小毒，可散結(jié)消癭、清熱解毒、涼血降火、化痰散結(jié)［3～4］。藥理學(xué)研究表明，黃藥子具抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌等功效［5～6］。生長于黃獨莖蔓上的珠芽俗稱“零余子”，在組培中特稱為微型塊莖，可用作藥膳直接食用［7］，還可作繁殖材料用于黃獨的大田生產(chǎn)［8］。

黃藥子含薯蕷皂苷元（diosgenin）等甾類成分［9］，可用于合成口服避孕藥及各種激素類藥物［10～12］。薯蕷皂苷元來自于萜類合成途徑［13］，角鯊烯（Squalene）是植物萜類化合物生物合成的共同前體［14］。鯊稀合酶（squalene synthase，SQS）可催化2分子的法呢基焦磷酸（FPP）產(chǎn)生1分子的前鯊烯焦磷酸（PSPP）［15］，并可催化PSPP 縮合產(chǎn)生角鯊烯。因此，鯊稀合酶含量和活性決定了薯蕷皂苷元的產(chǎn)量［16］。研究表明，SQS 在薯蕷屬植物中過量表達(dá)能夠明顯提高薯蕷皂苷元的含量［17］。

近年來，黃獨的藥用價值愈加得到人們重視，黃獨的市場需求較為旺盛，造成黃獨資源的缺乏。因此，采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行育苗，是提高黃獨種苗的有效途徑。采用基因工程手段來調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶SQS 在甾醇和三萜類化合物代謝途徑中的表達(dá)，從而促進(jìn)藥用活性代謝產(chǎn)物的積累具有重要意義及應(yīng)用價值［18］。目前，對黃獨的莖尖脫毒快繁［19］、種質(zhì)超低溫保存［20］以及微型塊莖誘導(dǎo)形成［21］等方面已經(jīng)開展研究，今后利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法提高薯蕷皂苷的產(chǎn)量，也是薯蕷皂苷生產(chǎn)的一個總方向［22］。本文以黃獨微型塊莖為材料，克隆其皂苷合成代謝途徑中的黃獨鯊稀合酶（SQS）基因，并對其進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步研究黃獨SQS 基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、基因突變提供了基礎(chǔ)，為薯蕷屬植物三萜合成通路關(guān)鍵酶SQS 的正選擇位點與功能的關(guān)聯(lián)性分析提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

黃獨試管苗微型塊莖由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

從黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選的SQS基因中間序列為基礎(chǔ)，利用primer 5.0 軟件設(shè)計引物：RC190-SQS-1F（GGTAGAGACWGTTGATGACTATGATGA）；RC190-SQS-1R（TCTCCTCATATTTCAAATCCTCWAG）；RC190-SQS-1R1（TTCCAATYGCCATGAYCTGA）。接頭引物：3′adaptor（GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT）；5.3′outer（GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC）；5.3′inner（GCTACGTAACGGCATGACAGTG）；AUAP（GGCCACGCGTCGACTAGTAC）；AAP（GCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG）。3′RACE 特異性引物：RC190-SQS-F1（CTGGGTTGGTTGGATTGGGACTTTCT）；RC190-SQS-F2 （CACGAATGTTTTGGCCTCGTCACAT）；RC190-SQS-F2i（ATCGACATATATGATGTAGA）。5′RACE特異性引物：RC190-SQS-R6（CATATTTACTCCAAATGTGACGAGGCCAA）；RC190-SQSR5（TGGAGTTCTCCTCATATTTCAAGTCCTCAA）；RC190-SQS-RT1（GCCATGTACGTAAGGCAATCCTCAGCA）。

1.2.2 RNA抽提與純化

按照柱式Trizol 總RNA 提取試劑盒（生工試劑盒SK1312）說明進(jìn)行。1.5%瓊脂糖，1×TAE 電泳緩沖液，紫外透射光下觀察并拍照。

1.2.3 cDNA第一鏈合成

在0.2 mL PCR 管中加入以下試劑（10μL total RNA；1 μL 3′adaptor）。70°C 溫浴5 min。冰浴2 min，離心加入下列試劑（4.0 μL 5X First-Strand Buffer；2 μL 10 mmol·L-1dNTP；1 μL Rnase inhibitor；2 μL Reverse Transcriptase；20.0 μL Total volume）。42°C溫浴60 min，72°C溫浴10 min。

1.2.4 基因調(diào)取

PCR 反應(yīng)體系：2×GC Buffer Ⅰ12.5 μL；F（10μmol·L-1）0.5 μL RC190-CAS-1F；R（10 μmol·L-1）0.5 μL RC190-CAS-1R/RC190-CAS-1R1；dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL；ddH20 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL?？傮w積25 μL。PCR 循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個循環(huán)。按照柱式DNA 膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR 電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物膠回收測序。

1.2.5 3′RACE

巢氏PCR 反應(yīng)體系（以3′adaptor 為反轉(zhuǎn)引物的cDNA 為模版）：第一輪【2×GC Buffer Ⅰ12.5μL；F（10 μmol·L-1）RC190-CAS-F3 0.5 μL；R（10μmol·L-1）0.5 μL（5.3′outer）；dNTP（2.5 mmol·L-1）4μL；ddH2O 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL；總體積25 μL】；第一輪【2×GC Buffer Ⅰ25 μL；F（10 μmol·L-1）RC190-CAS-F4 1μL；R（10 μmol·L-1）1 μL（5.3′inner）；dNTP（2.5 mmol·L-1）8 μL；ddH2O 12.5 μL；Template 1 μL（第一輪PCR 稀釋產(chǎn)物）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.5 μL；總體積50μL】。PCR 循環(huán)條件：第一輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個循環(huán)）；第二輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33 個循環(huán)）。按照柱式DNA 膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR 電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物膠回收測序。

1.2.6 5′RACE

巢氏PCR 反應(yīng)體系（末端加C 法，以特異性引物RC190-CAS-RT1/RC190-SQS-RT1 反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT 處理后，進(jìn)行巢氏PCR，操作步驟見invitrogen 5'race system manual）：第一輪【2×GC Buffer Ⅰ12.5 μL；F（10 μmol·L-1）0.5 μL（AAP）；R（10 μmol·L-1）0.5 μL（RC190-CAS-R5/RC190-CAS-R9）；dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL；ddH2O 6.3 μL；Template 1 μL（cDNA）；Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL；總體積25 μL】；第一輪【2×GC Buffer Ⅰ25μL；F（10μmol·L-1）1μL（AUAP）；R（10μmol·L-1）1 μL（RC190-CAS-R6/RC190-CAS-R10）；dNTP（2.5 mmol·L-1）8μL；ddH2O 12.5μL；Template 1μL（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物）；Taq酶（5 U·μL-1）0.5μL；總體積50μL】。PCR循環(huán)條件：第一輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33個循環(huán)）；第二輪（95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸60 s；72℃修復(fù)延伸7 min。33個循環(huán)）。按照柱式DNA膠回收試劑盒（生工試劑盒B518131）進(jìn)行PCR電泳與回收。1%糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物克隆測序。

1.2.7 序列拼接

利用DNAMAN 軟件將中間序列及RACE 實驗得到的序列進(jìn)行拼接，得到基因全長序列。

1.2.8 分析方法

測序獲得的基因cDNA 序列經(jīng)NCBI 的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服務(wù)器，進(jìn)行開放閱讀框分析。此外，借助Prot-Param pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi）、GOR IV（http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_gor4. html）、SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測目標(biāo)序列一、二、三級結(jié)構(gòu)；再依次利用SigalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）軟件預(yù)測基因編碼氨基酸的信號肽和疏水性/親水性；最后使用Blastp 工具在NCBI 上查找基因同源氨基酸序列，并運用MEGA4.0 軟件中的近鄰相接法（nerghborjoining，NJ）（1000 BootStrap）構(gòu)建同源進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取

黃獨微型塊莖總RNA 的電泳圖見圖1。左側(cè)泳道可清晰觀察到28S 和18S 兩條區(qū)帶，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可用于RT-PCR。

2.2 黃獨微型塊莖SQS基因克隆

通過RACE 技術(shù)（見圖2），得到全長為1 548 bp 的cDNA 序列，經(jīng)NCBI 的ORF finder 進(jìn)行開放閱讀框分析，得到415 bp的氨基酸序列。

2.3 SQS基因預(yù)測氨基酸的一級結(jié)構(gòu)分析

ProtParam pI/Mw 軟件預(yù)測顯示，SQS 編碼蛋白的理論分子量Mw 為46 786.38 D，等電點（pI）為5.97。

2.4 SQS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

由GOR IV 軟件預(yù)測得知（見圖3），SQS 蛋白主要是由alpha 螺旋（藍(lán)色部分53.25%），延伸鏈（紅色部分10.84%）以及無規(guī)則卷曲（黃色部分35.90%）所構(gòu)成，本蛋白質(zhì)可能不包含有beta 折疊結(jié)構(gòu)。

2.5 SQS蛋白親水性/疏水性預(yù)測

通過Prot Scale 軟件預(yù)測分析（見圖4）發(fā)現(xiàn)，在SQS 蛋白質(zhì)氨基酸序列中，大部分殘基為疏水性，其中第109 與110 位具有最低分值，為-2.233，梳水性最強。大部分的親水性氨基酸殘基分值都處于較低的位置，其中第183 位具有最高分值，為3.822，親水性最強。預(yù)測SQS 蛋白具有較強的疏水性，為疏水性蛋白。

2.6 SQS蛋白信號肽預(yù)測與分析

SignalP 4.0 Server 軟件預(yù)測結(jié)果顯示，SQS 編碼蛋白的第24位苯丙氨酸殘基可能是信號肽原始剪切微店，其最高預(yù)測分值及最高的信號肽分值分別僅為0.125和0.12，第24位丙氨酸殘基的最高綜合剪切微店分值0.122，綜合分析結(jié)果表明SQS蛋白無信號肽。

2.7 SQS蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析（見圖5）顯示本蛋白質(zhì)主要由alpha 螺旋，延伸鏈以及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明SQS 蛋白包含有SQS 所必需的功能結(jié)構(gòu)域。

2.8 SQS蛋白功能預(yù)測

通過SQS 氨基酸序列比對KEGG 庫，得到直系同源KEGG 號：K00801（http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？K00801）。參與酶促反應(yīng)過程有：2 trans，trans-Farnesyl diphosphate（2，6-反式-法尼基二磷酸）＜=＞Diphosphate（二磷酸）+Presqualene diphosphate（角鯊烯磷二酸酯）；Presqualene diphosphate（角鯊烯磷二酸酯）+NADPH+H+＜=＞Diphosphate（二磷酸）+Squalene（角鯊烯）+NADP+；2 trans，trans-Farnesyl diphosphate（2，6-反式-法尼基二磷酸）+NADPH+H+＜=＞Squalene（角鯊烯）+2 Diphosphate（2二磷酸）+NADP+。

2.9 SQS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

保守區(qū)域預(yù)測結(jié)果如圖6所示，黃獨SQS蛋白屬于Isoprenoid_Biosym_C1 superfamily，具有典型的SQS基因結(jié)構(gòu)域。

2.10 SQS蛋白的氨基酸同源性分析

應(yīng)用NCBI 中的BlastP 程序，對SQS 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與Di?oscorea zingiberensis（盾葉薯蕷，AGN32410）的SQS蛋白氨基酸相似性為96.4%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也顯示，該蛋白與Dioscorea zingiberensis SQS 蛋白（AGN32410）親緣關(guān)系較近。

3 討論

我國薯蕷屬植物約有60 種，基本生長于長江以南，其中約40 種可藥用［23］。薯蕷皂苷元是薯蕷屬植物的主要有效化學(xué)成分，一種從植物膽固醇中提取的甾體化合物，是世界上合成甾體類藥物的典型起始中間體，商業(yè)上主要從薯蕷屬植物的根莖或塊莖中提取，具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等生物活性等［24～25］，也是醫(yī)藥工業(yè)合成甾體激素藥和口服避孕藥的重要工業(yè)原料［26］。薯蕷皂甙元是藥用植物的生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控是近年來的研究熱點［27］。SQS是所有三萜皂苷、甾醇、膽固醇等萜烯類重要物質(zhì)的共同前體［28］，因此對SQS 的研究具有重要意義。SQS 是一種微粒體酶［29］，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜［30］，是三萜皂苷類化合物生物合成的一個關(guān)鍵酶［31～33］。鑒于SQS 在類異戊二烯途徑中的關(guān)鍵地位［18］，目前已有很多藥用植物的SQS 基因被克隆和分析，如黑老虎［13］、牛樟芝［14］、建澤瀉［15］、浙貝母［17］、桑黃［18］等。然而有關(guān)薯蕷屬SQS 基因的研究少見報道。盾葉薯蕷鯊烯合酶包含一個1 230 bp 的開放閱讀框，編碼409 個氨基酸的多肽，預(yù)測分子量為46 kda，等電點為6.2［34］。本試驗通過對黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選到SQS 基因的中間序列核心片段，利用RACE 技術(shù)獲取該基因全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析表明，SQS 基因編碼序列長1 548 bp，編碼415 bp 的氨基酸序列，理論分子量Mw為46 786.38 D，等電點（pI）為5.97，與盾葉薯蕷的SQS 蛋白氨基酸相似性為96.4%。這是在黃獨中首次分離到該基因，研究結(jié)果為下一步利用該基因構(gòu)建表達(dá)載體，分析其在微型塊莖誘導(dǎo)形成過程中所具有的功能具有重要意義，同時，也為進(jìn)一步研究黃獨總皂苷合成代謝機制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。