基于芽苗砧嫁接油茶砧穗創(chuàng)傷后內(nèi)源激素動態(tài)變化分析

龍 偉 姚小華* 呂樂燕

（1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400；2. 浙江省林木育種技術(shù)研究重點實驗室，杭州 311400；3. 浙江同濟科技職業(yè)學院，杭州 311231）

油茶（Camellia oleifera A.）作為我國傳統(tǒng)的木本油料樹種之一，具有悠久的栽培和食用歷史，其籽壓榨后所得茶油具有的營養(yǎng)和保健功能被大眾認可，促進消費群體數(shù)量和市場消費量快速增加，從而帶動油茶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展［1～2］。隨著國家林業(yè)局于2017 年發(fā)布各省油茶主栽品種目錄［3］，助推優(yōu)良品種得到快速推廣，也使良種種苗需求急速提高。但因受遺傳特性影響，部分品種出圃率無法充分滿足市場需求，如被多省作為推薦品種的長林53 號，當年出圃率較低［4］，影響該品種的推廣應(yīng)用。因此如何提高該類生長緩慢品種的生長量，成為亟需解決的問題，需要對油茶嫁接苗各個環(huán)節(jié)深入了解。

研究發(fā)現(xiàn)，影響嫁接愈合和生長的因素較多，如油茶穗條質(zhì)量影響著嫁接后生長及存活率，采穗部位和穗條芽位等對嫁接苗生長有顯著影響［5～8］，而這些影響體現(xiàn)在砧穗理化差異，包括酚類、多酚氧化酶、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、水分以及內(nèi)源激素等［9～16］，對嫁接愈合有著顯著影響且為主要因素［17］。目前油茶嫁接繁殖方式主要以韓寧林［18］的芽苗砧嫁接，通過對穗條削兩面成楔形后插入莖段中間對剖的砧木內(nèi)；該過程對砧穗產(chǎn)生高強度切割，形成較大面積創(chuàng)傷，使砧穗剖面暴露于空氣易受到病菌和脫水的威脅。有研究顯示植物受創(chuàng)后將產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)形成對傷害或逆境時的自我防御機制，創(chuàng)傷部位分泌產(chǎn)生相應(yīng)產(chǎn)物抵御外界影響和促進愈合生長［19～22］，激素作為調(diào)節(jié)植物細胞生長和發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)，在該過程中起到重要的作用，推動植物再生［23～24］。但植物激素不是獨立個體存在，存在著拮抗和合作關(guān)系，且作為信號分子調(diào)節(jié)自身和其他激素含量變化，形成串擾作用［25～26］。這些過程說明創(chuàng)傷后，砧穗內(nèi)部發(fā)生一系列生化變化，且在生產(chǎn)中常將油茶穗條和砧木切割處理后進行保濕放置待嫁接，在此期間可能產(chǎn)生較多影響嫁接愈合的相關(guān)物質(zhì)，但目前對于該階段的變化情況研究較少，其對嫁接愈合的影響還未清楚。在前期對長林系列油茶種子及嫁接親和性的研究發(fā)現(xiàn)，長林53 號接穗嫁接親和性較高，但嫁接后第一年生長遲滯，而第二年快速生長，與生長旺盛的長林18號等相比，說明可能存在著影響嫁接生長的內(nèi)在因素（未發(fā)表）；同時對半同胞砧木研究發(fā)現(xiàn)長林18號砧木形態(tài)均勻，親和性高，因此為探索影響嫁接生長機制，對接穗和砧木互為砧穗情況下，模擬砧穗芽苗砧嫁接前處理方法和時間，對各階段內(nèi)源激素含量進行測定，探討砧木和接穗受創(chuàng)后的激素含量變化，有助于進一步摸清油茶砧穗嫁接愈合機理，從而為后續(xù)開展砧穗嫁接愈合機制研究提供技術(shù)和理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗林位于浙江省金華市婺城區(qū)東方紅林場的國家油茶核心種質(zhì)（浙江）資源庫內(nèi)，于秋季選擇樹齡6年、健康無病害的國家審定良種長林18號（下文簡稱18號）和長林53號（下文簡稱53號）樹體采集成熟果實，經(jīng)剝離、篩選出大小均勻的種子，置于4℃冰箱，于冬季經(jīng)高錳酸鉀消毒后平鋪在厚20 cm沙床上，再鋪上15 cm厚河沙貯藏。待翌年3月下旬開始按照1 次/周的頻率對沙床澆水催芽；5月份時，將砧木自沙床取出，清水沖洗干凈，濕毛巾包裹待用。同時在采果樹體上采集半木質(zhì)化時剪取芽位飽滿，選擇平均粗度在2.0～2.2 mm的春梢作為接穗，放入0℃冰盒內(nèi)，帶回實驗室進行處理。

1.2 試驗方法

穗條處理 截取穗條第二芽位至第三芽位間莖段，參照韓寧林［18］的芽苗砧嫁接方法對穗條處理削成楔形，將SCK（穗條未削面），穗條受創(chuàng)S0（0 min）、S10（10 min）、S40（40 min）后迅速投入液氮，待冷凍2 h后轉(zhuǎn)入到-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存；每處理3個重復(fù)。

砧木處理 將砧木莖段截去上部，保留長度2 cm，將ZCK（莖段未縱切）和砧木根系，莖段受創(chuàng)Z0（0 min）、Z10（10 min）后迅速投入液氮；砧木去除莖段和萌發(fā)種子后的根部整體投入液氨；上述砧木莖段和根部材料在液氮中冷凍2 h 后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存；每次處理3個重復(fù)。

激素測定 參照杜維等［27］和Pan［28］方法。使用AB 公司Qtrap6500 質(zhì)譜儀，采用HPLC-MS/MS方法對植物激素進行定量分析。對吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、玉米素（Zetin），反式玉米素（TZR）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）6種激素進行測定。將試驗材料在液氮中研磨至粉碎，準確稱量約1.0 g新鮮樣品，向粉末中加入10 mL異丙醇/鹽酸提取緩沖液，同時加入8μL 1μg·mL-1的內(nèi)標溶液4℃震蕩6 h；加入20 mL 二氯甲烷，4℃震蕩30 min；4℃，18 894 r·min-1離心5 min，取下層有機相；避光，以氮氣吹干有機相，以400μL 甲醇（0.1%甲酸）溶解；過0.22 μm 濾膜，進HPLC-MS/MS 檢測。色譜柱：poroshell 120 SB-C18 反相色譜柱（2.1×150，2.7 μm）；柱溫：30℃；流動相：A∶B=（甲醇/0.1%甲酸）∶（水/0.1%甲酸）；洗脫梯度：0～1 min，A=20%；1～9 min，A 遞增至80%；9～10 min，A=80%；10～10.1 min，A 遞減至20%；10.1～15 min，A=20%，進樣體積：2μL。質(zhì)譜條件氣簾氣：15 psi，噴霧電壓：4 500 v，霧化氣壓力：65 psi，輔助氣壓力：70 psi，霧化溫度：400 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 版和SPSS19.0 對采集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。在Excel 2010 中計算各性狀的平均數(shù)值規(guī)律。運用SPSS 19.0 開展單因素方差分析法（One-Way ANOVA）的LSD 和Duncan 檢驗對激素數(shù)值進行方差分析，并進行雙變量相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 穗條內(nèi)源激素含量的變化

穗條內(nèi)源激素含量在品種間存在差異（見圖1），18 號TZR、Zeatin 和SA 含量總體高于53 號。18 號的IAA、SA 和JA 含量在創(chuàng)傷后隨時間延長逐漸降低，SCK 及各時間點間存在顯著差異；ABA 在創(chuàng)傷后下降后逐步上升，在S10 達最高值327.562 g·kg-1，SCK 及各時間點間存在顯著差異；TZR 在創(chuàng)傷后快速上升，在S10時達最高值1.589 g·kg-1后逐漸下降，總體受創(chuàng)后高于SCK；Zeatin 在SCK 與受創(chuàng)各時間點均存在顯著差異，S0～S40 間無顯著差異。53號IAA 在S0下降，S10和S40上升且與SCK間無顯著差異；ABA 含量S0 達最高值436.969 g·kg-1，S0 與S40 存在顯著差異；TZR 含量在S10 出現(xiàn)低值0.305 g·kg-1，SCK、S0、S40 間無顯著差異；Zeatin創(chuàng)傷后逐漸下降，S10達到低值0.087 g·kg-1；SA在S10達最低值2 638.151 g·kg-1后上升，SCK與S0，S10 與S40 間無顯著差異；JA 在SCK 和S0 較低，S10升至最高值1 995.614 g·kg-1。

2.2 砧木莖段嫁接部位內(nèi)源激素變化

砧木莖段作為植物旺盛的生長部位，創(chuàng)傷前后品種間存在差異（見圖2）。IAA、Zeatin 和TZR在18 號和53 號間具有相似的變化，呈現(xiàn)Z0 降、Z10升趨勢，IAA、Zeatin在Z0與ZCK 和Z10存在顯著差異，除Zeatin 在Z10 高于CK，其他激素類型均低于ZCK。品種間18 號具有較高的ABA 和SA 含量；ABA 在各時期存在顯著差異，受創(chuàng)后含量下降至1.666 g·kg-1；TZR 在各時期間無顯著差異，Z10達最低值0.515 g·kg-1；SA 在Z0 與ZCK 和Z10 存在顯著差異；創(chuàng)傷后兩激素含量雖有所下降，但依然高于53 號，而JA 在砧木莖段ZCK 含量較低，創(chuàng)傷后Z10 時顯著提升，且53號具有較高的含量；53號的ABA和SA在Z0含量分被為1.666、12.910 g·kg-1，但隨后在Z10 開始下降，ABA 的Z10 與ZCK 和Z0存在顯著差異，SA 的ZCK、Z0、Z10 三者間存在顯著差異。JA 在兩品種間變化趨勢相似均在Z10 達到高值，激素含量53 號高于18 號，Z10 與ZCK 和Z0間存在顯著差異。綜上表明品種間隨受創(chuàng)時間的延長，內(nèi)源激素含量得到恢復(fù)；除JA 含量在53號較高外，其他激素含量18號高于53號。

2.3 砧木莖段和根部內(nèi)源激素含量分析

砧木根部和莖段的內(nèi)源激素含量存在差異（見圖3）。IAA 和ABA 莖段高于根部；TZR、Zeatin和JA 根部高于莖段。18 號的SA 莖段高于根部，53 號為根部高于莖段，且在根部內(nèi)含量較低。品種間18 號砧木內(nèi)源激素中的IAA、ABA、TZR、Zeatin和SA含量高于53號。

2.4 穗條受創(chuàng)后內(nèi)源激素相關(guān)性分析

創(chuàng)傷后品種間相關(guān)性在部分激素間存在明顯差異（見表1）。18 號穗條內(nèi)IAA 與SA（r0.01=0.977）和JA（r0.01=0.943）存在極顯著正相關(guān)，與TZR 存在顯著正相關(guān)（r0.05=0.700）；TZR 與Zeatin存在極顯著相關(guān)（r0.01=0.733），與SA和JA呈顯著相關(guān)；SA與JA存在極顯著相關(guān)（r0.01=0.962）。53 號IAA 與ABA（r0.05=-0.763）和SA（r0.01=-787）存在顯著負相關(guān)，與JA（r0.05=0.845）存在極顯著正相關(guān)，TZR 與Zeatin、SA 存在極顯著正相關(guān)，與JA（r0.01= -0.874）存在極顯著負相關(guān)；Zeatin 與SA（r0.01=-0.806）存在極顯著正相關(guān)，與JA（r0.01=-0.846）存在極顯著負相關(guān)，SA與JA（r0.01=-0.891）存在極顯著負相關(guān)。綜上表明18 號創(chuàng)傷后各激素間多為正向協(xié)同變化，生長素含量受多種激素影響；53 號促進細胞分裂激素與抗病菌類激素SA 協(xié)同正向變化，但受抗逆境激素ABA 和JA 的負調(diào)節(jié)，表明環(huán)境脅迫時可能影響到愈傷組織的形成。

2.5 砧木受創(chuàng)后內(nèi)源激素間相關(guān)性分析

表1 受創(chuàng)后穗條內(nèi)源激素間的相關(guān)性分析Table 1 The analysis of correlation among endogenous hormones in scions after wound

砧木莖段受創(chuàng)后內(nèi)源激素相關(guān)性結(jié)果顯示品種間存在差異（見表2）。18 號除IAA 與ABA 和SA，ABA 與JA 存在顯著正相關(guān)外，其他激素間存在極顯著正相關(guān)。53 號的IAA 與Zeatin（r0.01=0.918）存在極顯著相關(guān)，與TZR（r0.05=0.856）存在顯著相關(guān)；TZR與Zeatin（r0.01=0.937）和JA（r0.01=0.973）存在極顯著正相關(guān)，與SA（r0.05=0.845）存在顯著負相關(guān)；JA 與SA（r0.01=-0.915）存在極顯著負相關(guān)。綜上表明18 號受創(chuàng)后內(nèi)源激素間正向協(xié)同變化，促進細胞分裂生長的同時抵御外界影響；53 號內(nèi)源激素間僅部分存在顯著或極顯著相關(guān)性，SA 與JA 和細胞分裂素類（TZR 和Zeatin）的負相關(guān)顯示出病菌侵害引發(fā)SA 含量增加時，將延滯細胞愈傷組織形成，降低抗逆境激素水平。

表2 砧木受創(chuàng)后內(nèi)源激素間的相關(guān)性分析Table 2 The analysis of correlation among endogenous hormones in rootstocks after wound

表3 砧木莖段和根部內(nèi)源激素間相關(guān)性分析Table 3 The analysis of correlation among endogenous hormones in stem and roort of rootstocks

2.6 砧木莖段和根部內(nèi)源激素間相關(guān)性分析

砧木根莖作為整體的內(nèi)源激素相關(guān)性在品種間總體相同，但SA 在品種間有所不同（見表3）。IAA 與ABA 存 在 極 顯 著 正 相 關(guān)，IAA 和ABA 與TZR、Zeatin和JA存在極顯著負相關(guān)，TZR與Zeatin和JA 存在極顯著正相關(guān)，Zeatin 與JA 存在極顯著正相關(guān)；18 號中SA 與IAA、ABA 存在極顯著正相關(guān)，與TZR、Zeatin 和JA 存在極顯著負相關(guān)；53 號為SA 與IAA、ABA 存在極顯著負相關(guān)，與TZR、Zeatin和JA存在極顯著正相關(guān)。以上表明未創(chuàng)傷時根莖激素間的協(xié)同或抑制水平，SA作為防御病菌侵害的激素可能影響著兩品種嫁接后的愈合和生長。

2.7 穗條受創(chuàng)后內(nèi)源激素間比值分析

激素間既相互制約也相互促進，品種間激素比值存在差異（見圖4）。兩品種的IAA/TZR、IAA/Zeatin 值較高；IAA/TZR 和IAA/Zeatin 在53號S0均下降，S10 時分別達到17.99 和63.42 高值后下降；而18 號在SCK 分別達最高值23.26 和31.04 后逐漸下降，S40 時達最低值。ABA 與TZR 和Zeatin 比值高于ABA/JA；ABA/Zeatin和ABA/TZR均在53號S10 時達最高值，分別為4 720.64 和1 346.88，且變化趨勢相同；18 號最高值分別在S10 和SCK，其值分別為1188.41 和1519.20，兩比值變化趨勢不同。品種間SA/JA 為53 號＞18 號，而在SA/ABA為；53 號SA/JA 在SCK 時最高，隨后下降，而SA/ABA 較為穩(wěn)定；18 號兩比值創(chuàng)傷后呈現(xiàn)相反趨勢，SA/JA 逐漸上升，在S40 時達最高值4.99，而SA/ABA 隨時間逐漸下降。TZR/SA 和TZR/JA 為18 號＞53 號，18 號 最 高 值 在SCK 為21914.51 和3797.86，隨創(chuàng)傷時間增加而降低。綜上表明53號創(chuàng)傷后IAA 和ABA 與其他激素比值高于18號，S10 為峰值。

2.8 砧木受創(chuàng)后內(nèi)源激素間比值分析

砧木受創(chuàng)后激素比值差異顯著（見圖5）。IAA 與ABA、TZR 和JA 比值在各時期變化較小，IAA/Zeatin值在品種間和處理間存在差異，Z0達到高值，18 號和53 號分別為61.07 和647.16。ABA與各激素比值在品種間變化趨勢不同，創(chuàng)傷后53號高于18 號；創(chuàng)傷后53 號ABA/Zeatin 值在Z0 達421.24，高 于ZCK 的10.20 和Z10 的30.98；18 號ABA/Zeatin 值在ZCK 最高為37.60，受創(chuàng)后Z0 和Z10 均低于該值，ABA 與TZR 和JA 的比值較低。SA/ABA 和SA/JA 值 在53 號 總 體 低 于18 號，SA/ABA＞SA/JA，兩比值在53號Z0達最高值，分別為6.56 和0.60，而18 號的兩激素比值在ZCK 達最高值19.09 和8.75 后，隨受創(chuàng)時間延長而逐漸降低。TZR/SA 和TZR/JA 值在品種間存在巨大差異，53號最高值分別為ZCK 的0.12 和0.03，18 號則分別為ZCK的105.37和Z10的50.72。以上表明砧木莖段創(chuàng)傷后產(chǎn)生的激素在種類和比值具有顯著差異，顯示出品種特性對植物應(yīng)激反應(yīng)的影響，這些因素可能使砧木在嫁接后產(chǎn)生明顯不同的嫁接愈合效果。

3 討論

本研究中穗條除SA 和JA 外，53 號受創(chuàng)前含量優(yōu)于18 號；由于SA 和JA 分別作為抵御病菌和快速響應(yīng)逆境并激活干細胞修復(fù)受損細胞的激素［22，29～30］，說明18 號自身防御能力較高；受創(chuàng)后53號ABA、SA、JA 含量占優(yōu)，顯示較強的應(yīng)激防御機制。由于IAA 作為信號感知、傳遞，進而調(diào)控植物生長發(fā)育的重要激素，脅迫環(huán)境提高IAA 含量，誘導(dǎo)原形成層細胞的生成［31～33］，有研究表明高濃度的生長素，原形成層細胞在細胞分裂素降低后進一步分化植物維管束系統(tǒng)的形成，而細胞分裂素是受創(chuàng)后愈傷組織形成的關(guān)鍵激素，激活多個發(fā)育調(diào)控因子［34］；受創(chuàng)后18 號在促進細胞生長和增殖的激素含量及生長素/細胞分裂素比值具有優(yōu)勢，相較更有利于愈傷組織形成和分化。由于生產(chǎn)中18號生長旺盛而53號遲滯生長，激素間53號抗逆類激素與生長素和細胞分裂素間極顯著負相關(guān)，是否穗條較高的防御機制影響嫁接后器官分化和生長還有待進一步研究。18 號和53 號內(nèi)均測出IAA 分別為3.87 和3.52 mg·kg-1，但杜維等報道油茶枝條中未檢測到IAA［27］，可能品種因素影響枝條內(nèi)源激素含量。

砧木根部和莖段作為整體為嫁接后生長提供支持，特別是根系為合成植物激素等物質(zhì)的源庫，與莖段間通過調(diào)控其輸出或輸入內(nèi)源激素來影響激素含量，進行信息交流和協(xié)調(diào)生長，使植株內(nèi)部相互促進或抑制的內(nèi)源激素水平達到平衡［35～37］。本研究中兩品種的根莖激素相關(guān)性r0.01＞0.9說明受創(chuàng)前內(nèi)源激素處于平衡狀態(tài)，且砧木莖段具有較高的IAA 和ABA，而根系內(nèi)則細胞分裂素（TZR 和Zeatin）和JA 占優(yōu)，除JA 外18 號總體高于53 號。細胞分裂素作為重要的根源信號分子，根系產(chǎn)生的細胞分裂素響應(yīng)脅迫傷害中發(fā)揮著重要作用［38］。砧木莖段受創(chuàng)后JA 在53號處于較高水平，其他激素18號總體依然高于53號，同時從ABA和SA 變化趨勢的差異，反映出JA 可能為53 號創(chuàng)傷脅迫的主要激素。由于內(nèi)源激素間存在拮抗和協(xié)同的作用，相較18號受創(chuàng)后各激素間密切的聯(lián)系，53 號激素含量間無顯著相關(guān)性，可能受到根系等其他因素影響。由于馮金玲等發(fā)現(xiàn)嫁接部位ABA/TZR、ZR/IAA 等激素比值影響嫁接口形成及形態(tài)建成方向［16］，砧木莖段內(nèi)IAA/TZR、IAA/Zeatin、ABA/Zeatin 在53 號 總 體 高 于18 號，而SA/ABA、SA/JA 和TZR/JA 比值18 號高于53 號，在砧穗貼合后激素利用與平衡影響嫁接部位愈傷組織形成和器官發(fā)育的機制還有待進一步研究。生產(chǎn)中不僅使用砧木莖段進行嫁接，也常用截取砧木根部嫁接繁殖，根部較高的細胞分裂素含量可能有利于嫁接愈合。

綜上所述，在創(chuàng)傷后砧穗產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，由于遺傳特性等因素的影響，對于逆境脅迫的響應(yīng)有所不同，產(chǎn)生的內(nèi)源激素含量存在差異；且隨著放置時間的延長，砧穗不同特性的內(nèi)源激素含量降低或升高，因此需要根據(jù)品種特性，設(shè)置合理的嫁接時間；18 號應(yīng)在10 min 內(nèi)嫁接完成為宜，53 號嫁接時間不超過40 min。上述討論結(jié)果表明53 號穗條創(chuàng)傷后抗逆激素較高，且后續(xù)嫁接后存活率較高的情況下［4，6］，且由于維管束等器官的發(fā)育依賴于生長素和細胞分裂素類等激素的作用，品種間對于脅迫的響應(yīng)差異，可能影響后期生長的因素在于嫁接部位用于營養(yǎng)及生長物質(zhì)傳輸?shù)木S管束等器官發(fā)育的滯后，抑制了芽位的萌發(fā)。因此有必要針對遲滯生長中嫁接部位、根和接穗進行一體研究，摸清油茶嫁接后砧穗愈合機理，從基因表達和生化角度進行分析，為后續(xù)開展精準育苗提供技術(shù)支持。