以溶血素為抗原的新型肺炎球菌疫苗的研究進展

劉宗華 綜述，薛巍 審校

暨南大學生命科學技術學院生物醫(yī)學工程系，廣東 廣州 510632

肺炎球菌是人類最常見的細菌性病原微生物之一，是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎和菌血癥等的主要病原體。據統(tǒng)計，全球每年約119萬人死于肺炎球菌感染，其中，主要為5歲以下兒童，且90%以上病例發(fā)生在發(fā)展中國家和欠發(fā)達國家［1-2］。兒童肺炎球菌感染已成為世界范圍內嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前，肺炎球菌感染的臨床治療措施主要為抗生素治療，但抗生素的廣泛應用使肺炎球菌的耐藥性問題日益嚴重。

針對肺炎球菌的感染和傳播，優(yōu)選方案是采用肺炎球菌疫苗進行提前預防。目前已上市的兩種肺炎球菌疫苗是基于肺炎球菌莢膜多糖所開發(fā)的23價肺炎球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcus polysaccharide vaccine，PPV23）和13價肺炎球菌結合疫苗（13-valent pneumococcus conjugate vaccine，PCV13）［3］。在歐美等發(fā)達國家，這兩種疫苗的廣泛使用在很大程度上降低了肺炎球菌感染疾病的發(fā)生，取得了良好的疾病預防效果。但這兩種疫苗仍存在制備成本高、血清型覆蓋率有限等局限性。此外，PPV23缺乏對2歲以下嬰幼兒的免疫原性［4］。PCV13克服了PPV23的許多局限性，但不能預防所有血清型的肺炎球菌感染，且存在“血清型替代”問題，即非疫苗血清型的擴張，這是由于從接種人群中剔除了與之競爭的疫苗血清型，而使其能夠定植宿主［5］。

為了克服上述傳統(tǒng)多糖疫苗的局限性，急需開發(fā)廣譜的新型肺炎球菌疫苗，以對更廣泛的肺炎球菌菌株提供更經濟的保護［6］。目前，新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)主要聚焦于蛋白疫苗、全細胞疫苗、DNA疫苗等［7］。由于在不同血清型菌株間高度的保守性，蛋白抗原成為新型肺炎球菌疫苗開發(fā)的重要突破口［8］。其中，已處于研究階段的肺炎球菌蛋白疫苗的候選抗原蛋白包括溶血素、肺炎球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A，PspA）和 PspC、肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesion A，PsaA）、依賴于ATP的酪蛋白溶解蛋白酶（ATP-dependent caseinolytic protease，ClpP）、假定脂肪酸蛋白連接酶（putative lipoate-protein ligase，Lpl）、膽堿結合蛋白 A（choline binding protein A，CbpA）等［9］。研究表明，所有肺炎球菌血清型均含這些候選抗原蛋白，可提供對肺炎球菌的有力保護［10］。本文對以溶血素為抗原蛋白的新型肺炎球菌疫苗的研究進展作一綜述。

1 肺炎球菌溶血素的結構及生物活性

溶血素是肺炎球菌主要的蛋白質毒力因子［11-12］，屬于結合膽固醇并在細胞膜上打孔的細菌毒素家族［13-15］。目前已知的97種肺炎球菌血清型幾乎均產生溶血素［16］。溶血素分子含471個氨基酸，相對分子質量為53 000，含4個不同的結構域［17-18］：結構域1、2、3維持溶血素分子的穩(wěn)定性；而結構域4（包括氨基酸殘基序列360-469）為該蛋白的C-末端序列，促進對靶細胞膜上膽固醇的結合，再在靶細胞膜疏水結合區(qū)域形成孔結構。多個毒素單體聚集起來，組裝成圓形的前孔結構，經過一系列構象轉變，形成β-圓桶型的穿膜孔，直徑為35 nm，每個孔含50個溶血素單體分子［19］。溶血素的靶向治療是增強肺炎球菌相關疾病療效的有利策略［20］。其中以溶血素為蛋白抗原開發(fā)的新型肺炎球菌疫苗［21］，能夠克服傳統(tǒng)多糖疫苗“血清型替代”的局限性，有廣泛的肺炎球菌血清型覆蓋率，具有極為重要的臨床應用價值以及重大的社會和經濟效益。

作為一種候選抗原，溶血素會在哺乳動物細胞膜上打孔而導致細胞壞死，其具有很大的細胞毒性，在很大程度上限制了其作為蛋白抗原的肺炎球菌疫苗的開發(fā)。理想的疫苗候選抗原應具備特異性、保守性、低毒性、能夠定位于病原表面等特征。30年前，溶血素即已被考慮作為疫苗抗原，但由于其固有的細胞溶解活性，無法直接使用天然的溶血素蛋白作為候選抗原，這成為該研究領域長期存在的關鍵問題。適當解毒并保持免疫原性的溶血素是理想的疫苗候選抗原。鑒于此，開發(fā)肺炎球菌溶血素疫苗所面臨的首要問題是必須解決溶血素的細胞膜裂解毒性。

2 溶血素的解毒

為了解決溶血素對細胞膜打孔的毒性問題，研究者采取了各種各樣的減毒措施，在不同程度上降低了溶血素的毒性，推動了基于溶血素為抗原的新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)。

2.1 溶血素的生物學解毒方法 為了降低溶血素的細胞裂解活性，研究者對其關鍵基因序列進行了各種基因工程修飾，見表1。早在1991年，澳大利亞的PATON研究組報道了一個廣泛研究的溶血素突變體，通常稱為PdB類毒素，在433位有色氨酸-苯丙氨酸取代（Trp433Phe）［22］。雖然 PdB 突變體是一個有希望的疫苗候選抗原，但其具有低水平的溶血活性。該突變體在宿主細胞膜中形成大孔，與野生型溶血素相比，其溶血活性保留了0.1%～1%。后來，該研究組又報道了幾種溶血素突變體：His367Arg、Trp433Phe Cys428Gly、Trp433Phe Cys428Gly Asp385-Asn，其細胞毒性分別為野生型溶血素的0.02%、0.000 1%和 0.000 1%［23］。

表1 溶血素的基因突變體Tab.1 Mutants of pneumolysin

英國格拉斯哥大學的KIRKHAM等［24］通過在具有寡聚功能的區(qū)域進行突變，構建了一系列溶血素突變體，從中篩選出兩種解毒溶血素突變體：一個是單一氨基酸缺失的溶血素突變體△A146 Ply，該突變體不能在細胞膜中打孔或刺激可由天然溶血素處理引起的體內炎癥效應，非常適合作為蛋白抗原；另一個是△6Ply，在參與寡聚的區(qū)域有一個雙氨基酸缺失（A146R147），與其他溶血素突變體不同，其顯示出良好的免疫原性而無打孔活性，且在體外不會誘導與人中性粒細胞的組織損傷相關的促炎活性［25］。

賽諾菲巴斯德制藥公司報道了一個高度解毒的溶血素突變體PlyD1［26］，其顯著優(yōu)點是具有雙重解毒機制。為構建PlyD1而設計的兩個關鍵突變是T65C和G293C，僅突變G293C可消除溶血素的溶血活性。此外，T65C和G293C的聯(lián)合突變，可在溶血素的1域與3域之間引入一個二硫鍵，以防止溶血素從前孔向成孔構象轉變。從疫苗安全性角度來看，這種內在的解毒機制雙保險非?？扇?。該公司還報道了一種系統(tǒng)的結構驅動法（systematic structuredriven approach），使用3種構象限制技術，合理地設計了缺乏溶血活性但仍能誘導針對野生型毒素的中和抗體的溶血素衍生物［27］。

吉林大學的SUN等［28］通過替換兩種氨基酸（C428G和W433F）開發(fā)了一種高度脫毒的溶血素突變體PlyM2，其失去了細胞毒性，但保留了誘導中和抗體的能力。

2.2 溶血素的其他解毒方法 溶血素解毒除了主要采用上述基因工程方法之外，還有一些化學和物理方法。瑞典的葛蘭素史克疫苗公司報道采用優(yōu)化的甲醛處理方法制備了一個完全解毒且解毒不可逆的溶血素，并有望大規(guī)模生產［29］。用該解毒溶血素處理實驗鼠，并通過注射部位的組織學分析證實了解毒效果。用該解毒溶血素免疫接種，誘導了溶血素特異性功能抗體，能夠在溶血實驗中抑制溶血素活性。此外，用該解毒溶血素免疫小鼠，可抵抗溶血素的致命鼻內攻擊，且鼻腔免疫接種可抑制同源或異源性肺炎球菌菌株的鼻咽定植［29］。上述研究表明，該解毒溶血素作為一種有效的候選抗原可用于進一步開發(fā)肺炎球菌疫苗。

在前期研究中我們嘗試采用納米技術來解決溶血素的毒性問題。對溶血素采用簡單的熱處理（70℃）和Fe3+復合的簡易物理方法，制備減毒溶血素納米顆粒疫苗制劑。該方法能有效降低溶血素的毒性，但在免疫接種實驗中未能誘導有效的抗體。推測其原因在于：熱處理會改變溶血素抗原的構象，從而破壞一些抗原決定簇的空間結構。

3 溶血素的佐劑／遞送系統(tǒng)

作為亞單位疫苗，純化的可溶性溶血素本身免疫原性較差，還需為其匹配合適的疫苗佐劑，用于輔助該抗原，誘導安全、有效的保護性免疫應答［30］。隨著對疫苗佐劑研究的不斷深入，依據其作用機理，可將疫苗佐劑分為免疫刺激分子和抗原遞送系統(tǒng)。前者主要通過直接刺激免疫系統(tǒng)而輔助抗原引發(fā)更高強度的免疫應答，后者主要通過有效的攜帶和遞送抗原而促進抗原的免疫應答。

3.1 與溶血素配伍的傳統(tǒng)佐劑 在新型肺炎球菌溶血素疫苗的開發(fā)過程中，針對解毒的溶血素抗原，主要是直接使用傳統(tǒng)的佐劑與之配伍，制備成疫苗制劑，如解毒的溶血素突變體 PdB［31］、ΔA146 Ply［24］、PlyD1［32］等均使用了鋁佐劑［33］。也有報道以單磷酸脂（monophospholipid，MPL）A 為佐劑，用于溶血素類毒素衍生物（a genetic toxoid derivative of pneumolysin，W433F，PdB）的免疫接種攻毒實驗［31］。

賽諾菲巴斯德制藥公司研究了由肺炎球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白D（pneumococcal histidine triad protein D，PhtD）、肺炎球菌膽堿結合蛋白A（pneumococcal choline binding protein A，PcpA）和解毒溶血素突變體PlyD1 3種抗原組成的實驗性肺炎球菌疫苗的免疫原性、穩(wěn)定性和吸附特性，結果表明，采用氫氧化鋁佐劑的每個抗原的抗體反應均顯著高于用磷酸鋁佐劑或無佐劑的抗原。較低的微環(huán)境pH值和較低的抗原吸附強度顯著提高了抗原的穩(wěn)定性?？乖姆€(wěn)定性與其在小鼠體內的免疫原性密切相關，表明用磷酸根離子預處理氫氧化鋁佐劑可提高其穩(wěn)定性。該研究發(fā)現，鋁鹽佐劑的類型（氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑）、吸附強度和微環(huán)境pH值對該疫苗的免疫原性和化學穩(wěn)定性有顯著影響［34］。

3.2 溶血素的新型遞送系統(tǒng) 與免疫刺激分子的佐劑原理不同，抗原載體／遞送系統(tǒng)能在抗原的負載、緩控釋、靶向抗原遞呈細胞、抗原攝入、抗原遞呈方式等各方面促進對抗原的有效遞送，在誘導體液和細胞免疫應答方面具有獨特優(yōu)勢。吉林大學的LU等［35］首先開發(fā)了一種高度脫毒的溶血素突變體Plym2，再以細菌樣顆粒（bacteria like particles，BLPs）為載體和免疫增強劑，將Plym2蛋白展示在該顆粒表面，研制成Plym2鼻黏膜接種疫苗。巴西的GOULART等［36］采用重組卡介苗（BCG）菌株（一種已知佐劑特性的結核病預防性疫苗）來表達并遞送PspA-PdT融合蛋白，制成新型肺炎球菌疫苗。

古巴的 GONZáLEZ-MIRó 等［37］在聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）珠上分別展示肺炎球菌血清型19F的溶血素和莢膜多糖，以增強免疫原性，評價了PHB珠作為蛋白抗原溶血素和莢膜多糖載體的潛力，檢測了疫苗接種后的體液和細胞免疫應答，用于預防肺炎球菌感染。為了在PHB珠表面展示溶血素，將溶血素與PHB合酶（PhaC）的N-端融合，該酶介導重組大腸埃希菌中PHB珠的組裝，展示溶血素的PHB珠作為抗原遞送系統(tǒng)。該研究組還采用化學方法將莢膜多糖19F偶聯(lián)至分離的PHB珠上，以進一步評估其抗原載體特性。

重慶醫(yī)科大學的WU等［38］將幾種主要的磷酸鈣生物礦化肽融合至溶血素解毒突變體ΔA146PLY的C-端，從而使生物相容性的磷酸鈣可與該蛋白一起礦化，以制備生物礦化的溶血素納米顆粒。他們制備了4種不同的納米粒子，并闡明了磷酸鈣結合域對納米粒子大小、形狀及表面鈣含量的影響，并研究了其免疫保護作用，以篩選出體外和體內最有效的制劑。

4 展望

以溶血素為抗原的新型肺炎球菌疫苗的開發(fā)，需從溶血素的解毒及其佐劑／遞送系統(tǒng)的選擇兩方面開展。在溶血素的解毒方面，除了現有的基因工程方法之外，還需進一步嘗試一些簡單、易行、有效的物理或化學方法，以便大規(guī)模生產；在溶血素的佐劑／遞送系統(tǒng)的選擇方面，仍需進一步嘗試更多的新型佐劑或抗原遞送系統(tǒng)，以輔助溶血素引發(fā)高效安全的免疫應答保護。