人類白細胞抗原-DPA1基因多態(tài)性與無胚胎妊娠的相關性

王振東，盧曉琳，姚秀英，劉鑫麗，趙琳琳，王理，牛勃，4

1.山西醫(yī)科大學生化教研室，山西 太原 030001；2.首都兒科研究所分子免疫室，北京 100020；3.陸軍總醫(yī)院263臨床部婦產(chǎn)科，北京 100024；4.首都兒科研究所轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究室，北京 100020

無胚胎妊娠也稱為枯萎卵妊娠，是指胚胎從未發(fā)育或再吸收，最終導致流產(chǎn)。無胚胎妊娠通常發(fā)生在懷孕婦女流產(chǎn)前12周，是妊娠早期較常見的流產(chǎn)，占自然妊娠的50%［1-3］。有研究表明，無胚胎妊娠可能與感染、免疫、染色體異常、內(nèi)分泌等多種因素相關［4］。

胎兒一半的遺傳物質(zhì)源于父本，因此可能會引起母體免疫系統(tǒng)的排斥反應，有研究證實，胚胎著床是母體胎兒復雜的免疫耐受過程，免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)在該過程中發(fā)揮重要作用［5］。婦女在育齡期發(fā)生自然流產(chǎn)大多數(shù)存在免疫異?，F(xiàn)象，其中約80%的復發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）與自身免疫因素相關［6-7］。

人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）也稱為主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC），負責免疫系統(tǒng)中的抗原表達，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類［8］。HLAⅠ類分子是NK細胞受體的配體，具有阻斷NK細胞活性的能力，起到保護胎兒的作用。胎盤滋養(yǎng)層細胞表達3種HLAⅠ類分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E），有研究證實，HLAⅠ類基因的缺失或突變可能導致流產(chǎn)［8］。AGRAWAL等［9］研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G基因多態(tài)性增加了RSA的風險。HLAⅡ類分子是一種固定在細胞膜上的異質(zhì)二聚體，由1條α鏈（DPA1）和1條β鏈（DPB1）構成，結合細胞外源性抗原肽后，可被CD4+T細胞識別，胎盤滋養(yǎng)層HLAⅡ類抗原的抑制是妊娠成功的一個重要機制。研究已經(jīng)證實，HLAⅡ類分子在胎盤滋養(yǎng)層細胞中的過表達可能誘發(fā)流產(chǎn)，但其具體機制尚未明確［10］。HLAⅡ類分子包括HLA-DP、DQ、DR、DN、DO和DM 共6個亞型，有研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)RSA患者體內(nèi)存在大量HLA-DQ或HLA-DR的表達［11-12］。目前對HLA-DP與流產(chǎn)相關性的研究較少，因此本研究采用高通量DNA分析技術，檢測無胚胎妊娠婦女外周血中HLA-DPA1基因的14個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），并分析HLA-DPA1的遺傳多態(tài)性與無胚胎妊娠的相關性。

1 材料與方法

1.1 樣本 選擇2016年5月～2018年9月間由中國人民解放軍總院263醫(yī)院經(jīng)產(chǎn)前B超檢查確診為無胚胎妊娠的110名患者作為研究對象，同時招募150名因非醫(yī)療原因流產(chǎn)患者作為對照。所有參與者均為漢族，無家族病史、特殊疾病及其他藥物作用和輻射效應，且均已提交知情同意書。本研究方案經(jīng)當?shù)貍惱砦瘑T會和首都兒科研究所IRB審核通過。經(jīng)患者靜脈采集外周血，于-30℃保存。同時記錄研究對象的年齡及孕周。

1.2 主要試劑及儀器 血液和細胞培養(yǎng)DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；NANODROP 1000分光光度計購自美國Thermo公司；帶有基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）的質(zhì)量陣列高通量DNA分析儀購自美國Angena公司。

1.3 DNA的提取 采用血液和細胞培養(yǎng)DNA提取試劑盒從血液樣本中提取基因組DNA，通過NANODROP 1000分光光度計測定260和280 nm波長下的吸光度值，檢測DNA的濃度和純度。

1.4 SNP的選擇及基因分型 從1000 Genomes數(shù)據(jù)庫中篩選出啟動子和HLA-DPA1基因全長區(qū)域的標記SNP，分別從NCBI SNP數(shù)據(jù)庫和NCBI pubmed數(shù)據(jù)庫中獲得外顯子SNP和熱點SNP，利用Haploview 4.2軟件分析上述SNP的連鎖相關性。

在 AgenaCx網(wǎng)站（https：／／agenacx.com／）設計漢族人群中等位基因頻率>0.10且與其他SNP有強連鎖不平衡的SNP（n=19）引物，設定r2<0.8，引物序列見表1，引物由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。以提取的樣本基因組為模板，PCR擴增SNP區(qū)域，PCR產(chǎn)物通過質(zhì)量陣列高通量DNA分析儀進行分析，同時以純水作為陰性對照，并對60%的樣本進行再分型，對基因分型頻率≥90%的HLA-DPA1基因的SNP進行基因型／等位基因頻率的分析。其他群體中SNP基因型／等位基因的頻率從1000 Genomes數(shù)據(jù)庫中獲得，并驗證與對照組樣本的相關性。

表1 SNP擴增的引物序列Tab 1.Primer sequences for SNP regions

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側，哈溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）的比較采用卡方檢驗；以OR值的 95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）為標準進行多元線性回歸，判斷與HLA-DPA1多態(tài)性相關的無胚胎妊娠風險；病例組和對照組孕周的比較采用獨立樣本t檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。在5%顯著性水平下，基于110例病例和150例對照的最小樣本量，應用Quanto軟件（http：／／biostats.usc.edu／Quanto.html）計算，當 OR 為 0.5時，檢測能力為99.99%。

2 結果

2.1 受試者年齡及孕周的比較 對照組及病例組受試者的平均年齡分別為（28.35±6.13）和（28.86±7.15）歲，平均孕齡分別為（6.84± 1.22）和（6.93±1.34）周，差異均無統(tǒng)計學意義（t分別為0.63和0.55，P分別為0.532和0.585）。

2.2 DNA的濃度及純度 對照組及病例組受試者血液樣本中提取的DNA濃度均在40 ng／μL以上，可用于PCR擴增，其在260與280 nm處的光吸收比值除少量在1.7～1.8或2.0～2.1之間，其他均在1.8～2.0之間；其在260與230 nm處的光吸收比值除少量在1.85～2.0之間，其他均在2.0以上。見表2。表明無過量蛋白質(zhì)、RNA或酚類物質(zhì)污染，可用于后續(xù)試驗。

2.3 HLA-DPA1基因頻率與樣本基本參數(shù)分析Haploview 4.2軟件分析結果表明，HLA-DPA1基因中共有14個SNP位點基因分型頻率在90%以上，除rs2073522在P<0.05時偏離HWE外，共對13個SNP位點進行統(tǒng)計分析，見表2。組間比較頻率時發(fā)現(xiàn)，除rs1431403外，所有SNP的基因型和等位基因分布在對照組和無胚胎妊娠組間非常相近（數(shù)據(jù)未顯示），rs1431403基因分型多態(tài)性檢出率為94.23%，其中對照組為143例，病例組為102例。

表2 SNP的詳細參數(shù)Tab.2 Detail parameters of SNP

2.4 rs1431403位點的基因型及等位基因多樣性分析 基因型／等位基因頻率分析結果表明，對照組與病例組rs1431403位點的等位基因頻率間無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但純合子基因型（CC 和 TT）明顯高于對照組（P<0.01），病例組純合子突變組合（CC+TT）部分也顯著高于對照組（P<0.001），見表3。表明該人群中rs1431403多態(tài)性可能與無胚胎妊娠風險呈正相關。

表3 對照組和病例組rs1431403位點基因型的比較Tab.3 Comparison of rs1431403 genotypes in two groups

2.5 rs1431403位點基因型和等位基因頻率在不同人群中的多態(tài)性分析 對照組rs1431403位點基因型／等位基因頻率與北京其他正常漢族人群間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），除日本和非洲人群的等位基因頻率與對照組差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），包括西雙版納中國傣族人口在內(nèi)的其他亞洲國家或其他洲的外國人群的rs1431403位點基因型／等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。表明對照組rs1431403位點基因型／等位基因頻率可代表漢族人群，且rs1431403位點在不同民族或種族人群中具有不同的基因型／等位基因頻率分布。

表4 不同民族或種族正常人群rs1431403位點基因型和等位基因頻率的多態(tài)性Tab.4 Polymorphisms of frequencies of rs1431403 genotype／allele in healthy populations of various nationalities or races

3 討論

本實驗基因分型結果表明，病例組CC與TT分型為40.2%和30.4%，分別比對照組高出19.2%和10.8%，CT分型為29.4%，比對照組低30.0%，病例組純合子突變組合（CC+TT）部分為70.6%，比對照組高30.0%；分型差異結果表明，HLA-DPA1基因中SNP位點rs1431403與無胚胎妊娠有顯著相關性，純合子基因型（CC和TT）明顯增加了無胚胎妊娠的風險。本實驗還將對照組中rs1431403位點基因型／等位基因頻率與北京其他正常漢族人群（1000 Genomes數(shù)據(jù)庫）進行了比較，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），該結果進一步證實了對照組rs14-31403位點基因型／等位基因頻率可代表漢族人群，其分布與包括西雙版納中國傣族人口在內(nèi)的其他亞洲國家或其他洲的外國人群相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明rs1431403位點與無胚胎妊娠的關系在不同民族中可能存在差異。

有研究發(fā)現(xiàn)，rs1431403位點的基因變異同時存在于HLA-DPA1和HLA-DPB1的內(nèi)含子區(qū)域，可能與類風濕關節(jié)炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病和HIV等免疫缺陷相關［13-14］。HLAⅡ類分子與外源性抗原結合為復合物，與CD4+T淋巴細胞（Th）表面受體（T cell receptor，TCR）結合，CD4+Th 的活化引起Th細胞增殖，表達相應的淋巴因子，進而啟動體液免疫［15］，表明HLAⅡ類分子增加可刺激CD4細胞上升。FERRERIA等［14］發(fā)現(xiàn)，rs1431403的C等位基因在Ⅰ型糖尿病和HIV中均可引起CD4／CD8的下調(diào)。YANG等［13］發(fā)現(xiàn)，rs1431403位點的變異顯著增加類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生，HLAⅡ類分子表達上調(diào)是類風濕性關節(jié)炎的檢測指標之一；也有研究表明，類風濕關節(jié)炎風險與HLA的基因多態(tài)性密切相關［16］。綜上所述，rs1431403位點的基因型與HLADPA1的表達可能存在關聯(lián)，rs1431403位點基因型可能是影響無胚胎妊娠發(fā)生的途徑，但具體病理機制有待進一步研究。轉(zhuǎn)錄因子結合位點預測（Alibaba 2.1，gene-regulation.com／pub／programs／alibaba2／index.html）發(fā)現(xiàn)，rs1431403下游4 bp處為干擾素共識序列結合蛋白（ICSBP）結合位點，ICSBP能夠促進HLA-DP表達［17］，但ICSBP與該位點的結合是否受rs1431403位點突變調(diào)節(jié)尚需證實。

綜上所述，HLA-DPA1中rs1431403位點的純合分型（CC或TT）是中國人群胚胎停育的潛在危險因素，該結果可能為自然流產(chǎn)的產(chǎn)前診斷提供線索，對優(yōu)生優(yōu)育具有積極意義。