牛傳染性鼻氣管炎病毒多表位嵌合蛋白的表達及免疫原性分析

仝曉丹 ，王俊 ，冉旭華 ，2，倪宏波 ，聞曉波 ，2

1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.海南大學動物科技學院海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南 ?？?570228

牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）又稱牛 1型皰疹病毒（bovine herpesvirus 1，BHV-1），是危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一種重要病原體，可導致鼻炎、陰道炎、腸炎、結膜炎、流產和腦炎等［1］，進而繼發(fā)其他病原體感染，加速動物死亡。IBRV急性感染后在三叉神經節(jié)形成潛伏感染，受到應激因素刺激后，可重新激活并向體外排毒，這給控制和消滅IBRV導致的相關疾病造成極大困難［2］。目前，一些國家通過撲殺陽性血清牛根除了該病，但耗資巨大，陽性率高的國家主要通過疫苗免疫來防控［3］。常用的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗和基因缺失疫苗。滅活疫苗雖能誘導較好的體液免疫，但免疫期短；弱毒活疫苗存在毒力返強可能。近年，歐洲一些發(fā)達國家多使用基因缺失疫苗用于牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）的防治與凈化，但基因缺失技術不完善，存在毒力返祖的可能性［4］。因此，研發(fā)更安全有效的疫苗在防控IBR中十分重要。由于基因工程亞單位疫苗具有穩(wěn)定性強、安全性高及易制備等優(yōu)勢，已成為疫苗的研究熱點，但其免疫原性較弱，限制了相關疫苗的研發(fā)進展［5］。與傳統(tǒng)基因工程亞單位疫苗比較，多表位疫苗除可克服MHC類分子限制獲得高效遞呈外［6］，還可消除多個全蛋白引起的容量限制［7］。

本研究利用基因工程方法制備含有IBRV已鑒定出的gB、gC和gD抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2的嵌合蛋白，并進行純化，檢測其在中國白兔體內的免疫原性，為進一步研發(fā)IBRV基因工程亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、質粒及菌株 MDBK細胞、IBRV、原核表達載體 pET-28a（+）、感受態(tài) E.coli DH5α 和感受態(tài)E.coli BL21（DE3）均由黑龍江八一農墾大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內切酶NheⅠ和HindⅢ購自美國Fermentas公司；連接試劑盒購自日本TaKaRa公司；質粒提取及膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；小鼠gD單克隆抗體由黑龍江八一農墾大學動物醫(yī)學重點實驗室制備保存；HRP標記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；Ni-NTA Purification System及Micro BCA Protein Assay Kit購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.3 實驗動物 清潔級中國白兔，雌性，70～75日齡，體重約2 kg，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號為：SCXK（黑）2017-008。

1.4 IBRV多抗原表位基因串聯設計 根據文獻報道的 gB［8］、gC［9］和 gD［10-11］相關抗原表位序列及gD［12］B細胞表位，分別以 AAYAAY及GGGGS為linker將抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2按不同方式排列組合，應用DNASTAR Protean軟件對其抗原性進行分析，選取抗原性參數較好的組合，并在串聯基因上設置酶切位點，委托北京華大基因公司合成，將合成的基因序列命名為P2-gB／gC／gD（GGGGS）及 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）。gB、gC和gD的相關抗原表位及破傷風毒素通用T細胞表位P2氨基酸序列見表1。

表1 P2及IBRV表位氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of P2 and IBHV epitopes

1.5 重組質粒的構建 將兩種重組的基因序列和載體pET-28a（+）分別用NheⅠ和HindⅢ雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，于16℃連接過夜；將連接產物轉化至感受態(tài)E.coli DH5α，37℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，接種至含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)6 h；按1∶100的比例轉接至3 mL含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。提取質粒進行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的質粒送至北京華大基因公司測序。

1.6 重組蛋白的表達 將兩種重組質粒及空載體pET-28a（+）分別轉化至感受態(tài) E.coli BL21（DE3），37℃培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，接種至含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃，200 r／min培養(yǎng)過夜；按1∶100的比例轉接至3 mL含50 μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至A600≈ 0.5時，加入IPTG至終濃度1 mmol／L，于37℃誘導4 h；6 000× g離心5 min，收集菌體，PBS洗滌3次，適量PBS重懸，經冰浴超聲破碎，12 000×g離心20 min，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的鑒定 采用Western blot法。沉淀菌體經12% SDS-PAGE分離后，轉至PVDF膜，用5%脫脂乳于4℃封閉過夜；加入小鼠gD單克隆抗體（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入DAB顯色液，ddH2O終止顯色。

1.8 重組蛋白的純化 重組菌經大量誘導后，收集菌體，PBS洗滌3次，加入含8 mol／L尿素的Dena-t uring Binding Buffer，重懸菌體，置于冰上，超聲破碎后，收集上清。Ni-NTA Purification System純化重組蛋白，產物經12% SDS-PAGE和Western blot鑒定。用含10 mmol／L Tris和0.1% Trionx-100的透析液，將純化產物于4℃透析過夜，以去除尿素，使蛋白復性，經Micro BCA Protein Assay Kit進行蛋白定量。

1.9 動物分組及給藥 將重組蛋白用PBS溶液稀釋至 200 μg／mL，按 1 ∶1（V／V）的比例加入 ISA206佐劑，進行充分乳化。取9只中國白兔，隨機分為3組：P2-gB／gC／gD（GGGGS）組、P2-gB／gC／gD（AAYAAY）和佐劑對照組（PBS溶液與ISA206佐劑等比例乳化）。經白兔后腿肌肉多點注射，前2組劑量為 100 μg／（mL·只），對照組劑量為 1 mL／只。每隔3周免疫1次，共3次，在免疫前及每次免疫后3周（即初次免疫后21、42和63 d），經白兔耳緣靜脈采血，分離血清，-20℃保存。

1.10 血清抗體水平的檢測 采用間接ELISA法。用0.05 mol／L碳酸鹽（pH 9.6）包被緩沖液稀釋濃縮后的 IBRV 至 2 μg／mL，按 100 μL／孔包被 96孔板，4℃過夜；用5%脫脂乳于37℃封閉2 h；加入待檢血清（1∶100稀釋），100 μL／孔，重復 3孔，同時設空白對照，37℃作用1 h；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），100 μL／孔，37 ℃作用1 h；加入 TMB 顯色液，100 μL／孔，37 ℃顯色 15 min，用酶標儀測定A450值。

1.11 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 7.00軟件進行統(tǒng)計分析，數據采用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用Two-way ANOVA方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IBRV抗原表位的選擇及串聯設計 DNA STAR Protean軟件分析表明，以圖1的方式連接抗原參數較好，抗原參數分析結果見圖2。

圖1 多表位序列串聯連接及酶切位點設置模式圖Fig.1 Schematic diagram of construction of multiple-epitope recombinant protein and setting of restriction endonuclease

圖2 多表位串聯序列抗原性分析結果Fig.2 Analysis of antigenicity of multiple-epitope tandem sequences

2.2 重組質粒的鑒定 兩種重組質粒雙酶切（NheⅠ／HindⅢ）產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均分別可見約1 100 bp的目的片段及約5 200 bp的載體條帶，見圖3。測序結果表明，目的片段序列與設計完全一致。

圖3 重組質粒的雙酶切（NheⅠ／HindⅢ）鑒定Fig.3 Restriction map of recombinant plasmids（NheⅠ／HindⅢ）

2.3 重組蛋白的鑒定 兩種重組質粒P2-gB／gC／gD（GGGGS）及 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）轉染菌分別可見相對分子質量約70 000和63 000的目的蛋白條帶，以包涵體形式表達，但條帶大于理論值（約44 000和48 000），見圖4。重組蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性反應，且于相對分子質量約70 000和63 000處可見特異性結合條帶，大于理論值，見圖5。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE profile of recombinant chimeric proteins

圖5 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blotting of recombinant chimeric proteins

2.4 純化產物的鑒定 SDS-PAGE及Western blot鑒定結果與2.3項一致，見圖6。重組蛋白P2-gB／gC／gD（GGGGS）和 P2-gB／gC／gD（AAYAAY）產量分別達12.4和15.3 mg／L。

圖6 純化蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）鑒定Fig.6 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified chimeric proteins

2.5 白兔血清中的抗體水平 初次免疫后21、42和63 d，P2-gB／gC／gD（AAYAAY）組白兔血清的抗體水平均顯著高于P2-gB／gC／gD（GGGGS）組（F分別為 63.2、214.2 和 579.2，P 分別為 0.011 3、<0.000 1 和 <0.000 1），見圖 7。

圖7 各組白兔血清的抗體水平Fig.7 Serum antibody levels of rabbits in various groups

3 討論

本研究通過查閱文獻獲得已鑒定出的gB、gC、gD相關抗原表位，采用原核表達系統(tǒng)表達多表位串聯連接的重組嵌合蛋白，并以家兔為動物模型，對其免疫原性進行評價。鑒于基因工程亞單位疫苗免疫原性弱的特點，在多表位序列串聯的基礎上，前段串聯一種通用T細胞表位P2，其為破傷風毒素表位，具有促進抗體的分泌，延長抗體持續(xù)期等作用［13-15］。為避免抗原表位間相互干擾形成新的表位，影響免疫原性，本實驗在表位間采用linker進行連接。linker在嵌合蛋白表達中對蛋白的正確折疊、加工和生物活性發(fā)揮重要作用［16］。Linker按功能特性可分為剛性和柔性兩種，柔性linker連接的嵌合蛋白具有良好的親水性和伸展性；剛性linker雖親水性較差，但可使各表位間互無干擾，維持良好的抗原參數［17］，但還需根據動物免疫效果來確定。因此，為選擇適合該嵌合蛋白的linker，分別設計構建了以GGGGS和AAYAAY兩種linker連接的嵌合蛋白，并將兩種純化蛋白分別與ISA206佐劑乳化后免疫中國白兔，檢測結果發(fā)現，AAYAAYlinker連接的嵌合蛋白誘導產生的抗體水平明顯高于GGGGSlinker連接的重組蛋白（P<0.05）。且SDS-PAGE分析表明，兩種不同linker連接重組蛋白的相對分子質量均比理論相對分子質量偏大，推測其除蛋白自身結構影響外，還有可能與His-Tag標簽有關，His-Tag標簽含有6個連續(xù)的組氨酸，屬于堿性氨基酸，攜帶較強的正電荷，使蛋白在SDS-PAGE中的泳動速率減慢，從而導致蛋白的相對分子質量偏大［18］。另外，Western blot鑒定結果顯示，該蛋白可與gD單克隆抗體發(fā)生特異性結合，表明表達的蛋白為P2-gB-gC-gD重組蛋白。

目前，疫苗接種是防控IBR的最有效途徑，國外多采用基因缺失疫苗防控和凈化IBRV，主要包括gE、TK和US2相關基因缺失疫苗［19-21］。但該類疫苗在懷孕母牛和犢牛的預防免疫上存在風險［22］。國內尚無商品化的基因缺失疫苗，均處于實驗研究階段［20，23］，其中 IBRV-BVDV 二價滅活疫苗的安全性和免疫效果還需進一步評估。與傳統(tǒng)疫苗比較，基因工程亞單位疫苗由于具有安全性高和易制備等優(yōu)勢成為研究熱點［24］，如侯亞蘭等［25］將 IBRV gD 與BVDV E2抗原表位進行連接，表達的重組嵌合蛋白具有良好的免疫原性。本研究表達的BHV-1重組多表位嵌合蛋白具有較好的安全性，但目前僅于家兔體內進行了初步免疫學評價，今后將在犢牛、青年牛及懷孕母牛體內進行安全性和免疫效力的評價。