鹽度對(duì)厭氧氨氧化脫氮性能及微生物群落的影響

李南錕， 杜 帥， 張培培， 劉 莉， 羅 娟

(1.生態(tài)環(huán)境部環(huán)境工程評(píng)估中心， 北京 100012； 2.北京國電富通科技發(fā)展有限責(zé)任公司， 北京 100070； 3.生態(tài)環(huán)境部環(huán)境規(guī)劃院， 北京 100012； 4.清華大學(xué)， 北京 100091)

厭氧氨氧化過程是在厭氧氨氧化菌作用下將氨氮和亞硝氮直接轉(zhuǎn)化為氮?dú)忉尫挪a(chǎn)生少量硝氮的過程[1]。厭氧氨氧化微生物反應(yīng)過程中，無需外加碳源，無需曝氣，而且由于產(chǎn)泥量極低，脫氮效率較高等優(yōu)勢被稱為本世紀(jì)最具有前景的脫氮工藝之一，并逐步開始應(yīng)用于各類復(fù)雜的污水處理中[2]。其中，高鹽廢水的脫氮處理就是其中備受關(guān)注的方向[3]。廢水中總?cè)芙夤腆w(TDS)和有機(jī)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3.5%或總含鹽量(以NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))大于等于1%即為高鹽廢水[4]。我國水資源時(shí)空分布嚴(yán)重失衡，淡水資源緊缺，由于人口眾多，導(dǎo)致人均淡水資源量較低，僅為世界平均水平的1/4，因此，從這個(gè)角度看，中國已是世界上最缺水的國家之一[5]。為了應(yīng)對(duì)我國的淡水資源危機(jī)，許多沿海城市使用海水代替淡水以滿足生活和生產(chǎn)活動(dòng)的需要，比如用作沖廁水、中水、消防用水等，此外，煉油、造紙、化肥、焦化以及食品等工業(yè)用水和農(nóng)業(yè)產(chǎn)生廢水具有水量大，含鹽高、碳氮比低、部分有毒性等特點(diǎn)[6]。對(duì)于高鹽廢水的處理，傳統(tǒng)的微生物脫氮以及物理化學(xué)方法具有成本高，效率低，難度大等劣勢[7]。

大部分厭氧氨氧化菌株提取自海水，因此對(duì)高氨氮、高鹽度廢水的處理具有天然的優(yōu)勢[8]。而且厭氧氨氧化過程完全自養(yǎng)，無需額外曝氣，無二次污染，脫氮效率高，近年來逐步應(yīng)用于工業(yè)廢水，農(nóng)業(yè)廢水和垃圾滲濾液等高鹽度廢水的脫氮應(yīng)用中，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[9]。以往學(xué)者研究顯示，鹽度30 g·L-1NaCl為鹽度的分水嶺，鹽度低于此值時(shí)，氮元素去除率均能維持在80%以上；高于30 g·L-1時(shí)，脫氮效率急劇下降[10-12]。此外，在30 g·L-1的NaCl高鹽廢水下同時(shí)馴化Scalindua和Kuenenia的兩種厭氧氨氧化菌種實(shí)驗(yàn)中，Kartal[13]等發(fā)現(xiàn)，Kuenenia在馴化后最終成為脫氮系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種。綜上可知，部分厭氧氨氧化菌種在高鹽度的廢水中仍舊能保持較高的活性，對(duì)高鹽度、高氨氮廢水有突出的優(yōu)勢，因此，對(duì)厭氧氨氧化系統(tǒng)在高鹽環(huán)境下脫氮性能及微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的深度分析具有較大意義。

本研究中，在穩(wěn)定運(yùn)行半年的顆粒化厭氧氨氧化污泥系統(tǒng)中，通過依次加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl進(jìn)行鹽度對(duì)系統(tǒng)影響實(shí)驗(yàn)?；诟咄繙y序技術(shù)，研究了高鹽度對(duì)厭氧氨氧化系統(tǒng)的脫氮性能及微生物群落的沖擊和影響，為后續(xù)高鹽低碳廢水脫氮的生物處理提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

采用水流自下而上天然厭氧的UASB反應(yīng)器，有機(jī)玻璃材質(zhì)，內(nèi)徑5 cm，高80 cm，有效容積1.5 L，較大的高徑比有利于厭氧氨氧化顆粒的進(jìn)一步形成和強(qiáng)化。具體見圖1。

1.進(jìn)水桶； 2.NaOH溶液； 3.三相分離裝置； 4.出水堰； 5.取樣口； 6.出水桶。圖1 反應(yīng)器示意圖

1.2 接種污泥與實(shí)驗(yàn)用水

實(shí)驗(yàn)進(jìn)水采用人工配水，以NaCl為主要的鹽度來源，以NaNO2和NH4Cl為氮源，其他組分包括NaHCO31000 mg·L-1，MgSO4·7H2O 100 mg·L-1，KH2PO430 mg·L-1，CaCl27.8 mg·L-1。微量元素1 mL·L-1微量元素成分：EDTA 5000 mg·L-1，MnCl2·4H2O 990 mg·L-1，CuSO4·5H2O 250 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1，CoCl2·6H2O 240 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 220 mg·L-1，NiCl2·6H2O 190 mg·L-1，H3BO414 mg·L-1[14-15]。

1.3 測試項(xiàng)目與方法

在系統(tǒng)進(jìn)水中分別加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl，每個(gè)濃度梯度運(yùn)行穩(wěn)定后，在反應(yīng)器取樣口提取3個(gè)平行微生物樣品，離心后冷凍儲(chǔ)存在-20℃冰箱中，3個(gè)鹽度濃度梯度分別標(biāo)記為A，B，C3組，每組3個(gè)平行樣品以A組為例，標(biāo)記為A1，A2，A3，以此類推。取樣完成后，所有樣本做好標(biāo)記，委托美吉生物公司測序平臺(tái)對(duì)所有樣品進(jìn)行微生物測序統(tǒng)計(jì)。本批樣品均采用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)作為引物,對(duì)V3～V4高變區(qū)域16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增分析.MiSeq文庫構(gòu)建和測序數(shù)據(jù)存于美吉生物測序公司i-sanger云平臺(tái)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)進(jìn)程

2.2 鹽度對(duì)系統(tǒng)氨氮去除率的影響分析

圖2 不同鹽濃度下厭氧氨氧化系統(tǒng)對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化效能

2.3 鹽度對(duì)系統(tǒng)亞硝氮去除率的影響分析

當(dāng)然，針對(duì)氨氮和亞硝態(tài)氮去除率偏差過大的情況，一部分原因是厭氧氨氧化運(yùn)行系統(tǒng)進(jìn)水中存在一定的溶解氧，因此反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)部并不是完全的厭氧環(huán)境，所以，系統(tǒng)內(nèi)部存在可以將氨氮氧化為亞硝態(tài)氮的氨氧化細(xì)菌，將部分氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，造成一定的亞硝態(tài)氮積累，使得氨氮去除率升高，亞硝態(tài)氮去除率降低，而造成了氨氮和亞硝態(tài)氮去除率偏差大的情況。

2.4 氨氮與亞硝氮轉(zhuǎn)化量與硝氮生成量的分析

Strous[21]等通過大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和計(jì)算，確立了厭氧氨氧化反應(yīng)的氮素之間關(guān)系如下所示：

圖3 不同鹽濃度下厭氧氨氧化系統(tǒng)對(duì)亞硝氮的轉(zhuǎn)化效能

因此，按理論值計(jì)算，亞硝氮和氨氮轉(zhuǎn)化率之比為1.32，硝氮生成量與亞硝氮轉(zhuǎn)化量之比為0.26。

圖4 氨氮、亞硝氮轉(zhuǎn)化量與硝氮生成量關(guān)系比較

2.5 系統(tǒng)微生物多樣性及豐富度分析

微生物多樣性和豐富度統(tǒng)計(jì)表1中可見，各階段的送檢樣品覆蓋度均大于0.99，說明測序結(jié)果具有參考價(jià)值。Ace指數(shù)和Chao指數(shù)[24]均是用來估算樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，兩者采用的算法不同，但指數(shù)數(shù)值都與物種的豐富度成正比。由表1可知，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)相互印證，說明隨著進(jìn)水鹽度的增加，厭氧氨氧化系統(tǒng)中物種的種類和豐富度明顯下降，充分體現(xiàn)出部分菌種不能在高鹽度的水環(huán)境下生存。

表1 微生物群落豐度和多樣性

Shannon指數(shù)[25]和Simpson指數(shù)[26]分別為微生物的多樣性的正比指數(shù)與反比指數(shù)。本研究中Shannon指數(shù)值隨鹽度上升明顯下降，而Simpson指數(shù)值卻為上升趨勢，二者均是對(duì)上述物種豐富度減少原因的印證，說明鹽度對(duì)部分微生物有明顯的抑制作用導(dǎo)致系統(tǒng)中微生物物種多樣性減少。

2.6 微生物門分類水平分析

系統(tǒng)中微生物的種類和相對(duì)豐度決定了系統(tǒng)的功能，因此，不同分類水平下對(duì)樣本中微生物種類和豐度的分析，對(duì)系統(tǒng)功能的解讀具有重要的意義[27]。如圖5門水平群落分布圖所示，在厭氧氨氧化UASB反應(yīng)器分階段所取微生物樣品中，浮霉菌門(Planctomycetes)是相對(duì)豐富度最大的菌門，然后依次為綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，經(jīng)研究確定的厭氧氨氧化菌種所在的浮霉菌門(Planctomycetes)在鹽度不斷增加的馴化實(shí)驗(yàn)中，豐度不斷增加，由最初 28.23%增長到 45.22%，物種相對(duì)豐度占比不斷提升，說明此類菌種可以在高鹽度的環(huán)境下依舊保持較高的活性和脫氮效率。此外，通過傳統(tǒng)的硝化反硝化方式脫氮的菌屬所在的變形菌門(Proteobacteria)[28～29]和厭氧氨氧化系統(tǒng)中對(duì)污泥顆?；头磻?yīng)器中生物膜形成的重要作用的綠彎菌門(Chloroflexi)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢[30]。而擬桿菌門(Bacteroidetes)隨著鹽度濃度不斷的提升，物種相對(duì)豐度有階梯式的提高，可能此菌門中存在某些菌屬可以極好的適應(yīng)高鹽度的水環(huán)境，在高鹽厭氧系統(tǒng)的脫氮中扮演著重要的角色。

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分別為添加10 g·L-1,20 g·L-1,30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集的3組平行微生物樣品)圖5 系統(tǒng)門水平群落分布圖

2.7 微生物屬分類水平分析

為了深入研究鹽度對(duì)系統(tǒng)中微生物群落的影響，繪制了屬水平群落分布圖以及Wilcoxon rank-sum檢測條形圖，進(jìn)一步對(duì)比隨著鹽度的增加微生物物種和相對(duì)豐度的變化情況。

從圖6中可知，Candidatus_Kuenenia相對(duì)豐度達(dá)到31.6%，是厭氧氨氧化系統(tǒng)中占比最高的菌屬，對(duì)系統(tǒng)的脫氮性能有決定性作用。由圖可知，隨著進(jìn)水鹽度濃度的變化，Candidatus_Kuenenia的物種相對(duì)豐度從31.6%下降到27.1%。相較于Jiang[31]等在厭氧氨氧化MVR系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)中得出，

(A1～A3，B1～B3,C1～C3分別為添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集的3組平行微生物樣品)圖6 系統(tǒng)屬水平群落分布圖

當(dāng)系統(tǒng)鹽度從0 g·L-1提升到30 g·L-1時(shí)Candidatus_Kuenenia菌屬從相對(duì)豐度占比從72.7%下降到13.5%的結(jié)果，可知厭氧氨氧化顆粒污泥系統(tǒng)對(duì)高鹽水環(huán)境有更好的抗沖擊能力。g_norank_f_Anaerolineaceae菌屬是厭氧氨氧化系統(tǒng)中綠彎菌門(Chloroflexi)最常見的菌屬，其通常存在于厭氧環(huán)境中，與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌協(xié)同降解系統(tǒng)中碳水化合物和其他細(xì)胞組織[32]。

Denitratisoma菌屬屬于變形菌門(Proteobacteria)一直保持著較高的豐度，是厭氧氨氧化系統(tǒng)脫氮性能的重要輔助成分。 SM1A02菌屬于浮霉菌門(Planctomycetes)，在ANAMMOX反應(yīng)器中普遍存在且相對(duì)豐度占比較大[33-34]。有文獻(xiàn)研究稱，SM1A02屬是活性污泥中的功能性細(xì)菌屬，被稱作潛在的新型厭氧氨氧化菌屬[35]。此外，norank_c_Chitinivibrionia在鹽度達(dá)到20 g·L-1時(shí)便從該系統(tǒng)中消失。在鹽度提升到20 g·L-1時(shí)Arenimonas菌屬的相對(duì)豐富度提升到最高，但是當(dāng)鹽度提升到30 g·L-1，Arenimonas菌屬相對(duì)豐度急劇減少幾近消失，不同的是Chryseolinea菌屬隨鹽度升高，豐度不斷提高。

圖7為屬水平Wilcoxon rank-sum檢測條形圖，圖中可以清楚地看出各樣本不同分組組中的平均相對(duì)豐度百分比的差值，最右邊為P值，P值越小，表示物種的變化越大。圖中可以清晰地看出norank_c_Chitinivibrionia和Arenimonas隨鹽度的提升，豐度出現(xiàn)明顯下降，這兩種菌屬均為專性厭氧，異養(yǎng)菌屬，其中Arenimonas為異養(yǎng)反硝化菌屬[36-38]。Chryseolinea豐度隨鹽度的提升而不斷升高，以往文獻(xiàn)中提到此菌屬是影響污泥沉降性能的關(guān)鍵菌屬，極易在厭氧環(huán)境下生存，有利于厭氧氨氧化顆粒的生成[39]。

(A,B,C分別為添加10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl鹽度環(huán)境下采集微生物樣品)圖7 屬水平Wilcoxon rank-sum檢測條形圖

3 結(jié)論

(1)通過逐步加入10 g·L-1，20 g·L-1，30 g·L-1的NaCl對(duì)顆粒厭氧氨氧化污泥系統(tǒng)進(jìn)行鹽度影響探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):鹽度從0 g·L-1增加到30 g·L-1過程中對(duì)氨氮去除率幾乎沒有影響，對(duì)亞硝氮去除率影響較大，亞硝氮去除率從95%降到65%。

(2)16SrRNA基因高通量測序分析研究結(jié)果顯示從門水平分析，隨著鹽度的增加，浮霉菌門(Planctomycetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加，而變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi) 豐度減少。

(3)Candidatus_Kuenenia是厭氧氨氧化系統(tǒng)中占比最高的菌屬，豐富度最高達(dá)到31.6%，是決定系統(tǒng)脫氮性能的主導(dǎo)菌屬，鹽度達(dá)到30 g·L-1時(shí)，其豐度下降至27.1%。潛在的Anammox菌屬-SM1A02菌屬隨著鹽度的提升，豐度占比有明顯的提升，此外，norank_c_Chitinivibrionia，Arenimonas,Chryseolinea是受鹽度影響相對(duì)豐度變化最大的3種菌屬。