海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉細(xì)菌性疾病病原鑒定及致病性研究

李赟，許巖，陳文博，張賽賽，孫陽，丁勇

（大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116023）

許氏平鲉（Sebastes schlegeli）隸屬于鲉形目（Scorpaeniformes）、鲉科（Scorpaenidae）、平鲉屬（Sebastes），別名“黑頭”“黑石鱸”“黑鲪”，我國主要分布地區(qū)為黃渤海一帶。由于其具有耐寒能力強(qiáng)、生長速度快、肉質(zhì)肥美等優(yōu)點(diǎn)，成為北方海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖中主要魚類之一[1-2]。大李家海域周邊是大連市大型海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的集中地之一，養(yǎng)殖的主要品種有紅鰭東方鲀、許氏平鲉等。近年來，隨著海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的上升，該區(qū)域網(wǎng)箱養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，疾病的發(fā)生也越來越頻繁，成為影響?zhàn)B殖成活率的關(guān)鍵因素。

此次許氏平鲉大規(guī)模染病現(xiàn)象于2019 年8 月出現(xiàn)在大李家街道近海海水網(wǎng)箱中，造成大多數(shù)許氏平鲉死亡。病魚的主要癥狀表現(xiàn)為：游動不規(guī)律，體表出現(xiàn)明顯創(chuàng)傷性潰瘍，鰭條潰爛，嚴(yán)重個(gè)體下顎潰爛，身體不能保持平衡等。經(jīng)過現(xiàn)場取樣后，在患病的魚體內(nèi)臟中分離出優(yōu)勢菌株，并驗(yàn)證該菌株的感染能力，從生化特性、形態(tài)特征等多個(gè)方面切入，確定了分離出的菌株為哈維氏弧菌，它同時(shí)也是其他諸多海水魚類流行性疾病的感染源之一[3-5]，筆者將分離得到的哈維氏弧菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以期為許氏平鲉的健康養(yǎng)殖提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病許氏平鲉取自大連金石灘海域養(yǎng)殖個(gè)體戶，8 月中旬發(fā)病，發(fā)病魚體長15～25 cm，體表及鰭已明顯出血，尾部和下顎潰爛。100 尾健康許氏平鲉來自大連天正實(shí)業(yè)有限公司養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)于75 L水族箱，采用充氣泵增氧，體質(zhì)量（25±2）g，體長（10±2）cm，每天進(jìn)行 1 次吸污，2 次投餌，暫養(yǎng)過程中養(yǎng)殖海水鹽度嚴(yán)格控制在32‰，水溫控制在24 ℃。藥敏紙片、弧菌科細(xì)菌生化鑒定管以及TCBS、TSB、2216 E 培養(yǎng)基均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌分離

為排除寄生蟲和真菌感染，選擇典型的體表潰爛的許氏平鲉，在顯微鏡下觀察刮取到的潰爛處組織以及鰓和體表粘液。將病魚的尾部用酒精棉球擦拭，使用2.5 mL 無菌注射器采用靜脈取血的方式在尾部取血液0.5 mL，然后將血液涂布在平板上；用接種環(huán)劃取體表潰爛處，劃線接種于2216 E 平板；在無菌環(huán)境下取病魚的腎、脾、肝等組織，經(jīng)磷酸鹽緩沖液研磨后，將研磨液同樣劃線接種于2216 E平板，培養(yǎng)溫度設(shè)置在28 ℃，孵育24 h。最后從菌群中選出形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落，對其純化培養(yǎng)三次得到純菌株，在-80 ℃下用TSB 凍存液（含15%甘油的TSB 培養(yǎng)基）保存。

1.3 人工感染試驗(yàn)

選取70 尾健康魚用于回感試驗(yàn)，試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于45 L 玻璃缸中，分成 7 組，每組10 尾，組別分配為空白組1 組、對照組1 組、試驗(yàn)組5 組。試驗(yàn)組在TSB 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，使用無菌PBS 洗滌三次，使用0.85%NaCl 溶液調(diào)整菌懸液的密度至3×107CFU/mL[6]。用生理鹽水對該菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后分別制成濃度為 3×106CFU/mL、3×105CFU/mL、3×104CFU/mL、3×103CFU/mL 的菌液。感染試驗(yàn)采用腹腔注射方式進(jìn)行，試驗(yàn)組每尾注射0.1 mL 菌液，對照組注射等量無菌PBS，空白組不注射。處理后每天對許氏平鲉的死亡和發(fā)病狀況進(jìn)行觀察，并按照正常飼養(yǎng)條件進(jìn)行吸污和換水，將觀察到的結(jié)果記錄下來，同時(shí)取出具有自然患病癥狀的人工感染發(fā)病許氏平鲉，再次對細(xì)菌進(jìn)行分離和純化。

1.4 病原形態(tài)與生理生化鑒定結(jié)果

采用劃線接種，在TCBS 和2216 E 平板上接種純化細(xì)菌，并在28 ℃下培養(yǎng)，孵育24 h 后，從理化特性和形態(tài)學(xué)等水平測定分離菌株的相應(yīng)指標(biāo)。依據(jù)文獻(xiàn)[7-8]的方法對理化特性進(jìn)行測定，即采用革蘭氏染色法對供試菌進(jìn)行涂片、染色，然后鏡檢供試菌的形態(tài)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

模板DNA 的制備：將待測細(xì)菌單菌落（純培養(yǎng)）置于50 μL 無菌去離子水中，沸水煮5 min，放置在冰上冷卻后瞬間離心，取上清液用作PCR 擴(kuò)增。使用文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行16 S rRNA 基因序列的PCR 擴(kuò)增與測序，擴(kuò)增產(chǎn)物送至天津華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。使用NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)確定16 S rRNA 基因序列的同源基因。通過以上方法確定了同源性較高的菌株，使用Clustalx 軟件將其與所得菌株16 S rRNA 基因的序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行置信度檢測，檢測1 000 次。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

根據(jù)美國NCCLS 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法[10]，測定14 種抗生素對于分離菌株是否有效，使用K-B 法測定分離菌株的敏感性。使用28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)營養(yǎng)肉湯中的菌株，并將菌液的濃度調(diào)整到3.0×107CFU/mL，培養(yǎng)24 h。在MH 瓊脂上均勻涂布150 μL 菌液，使用各種藥敏紙片，在28 ℃下孵育24 h，測量抑菌圈直徑大小，對照藥敏紙片說明確定該菌株對于各種抗菌素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚檢查

患病魚體表潰瘍，鰭條略有潰爛。解剖病魚發(fā)現(xiàn)腸有少量積水，顏色較淺。在對病灶、鰓以及粘液等組織鏡檢后，并未發(fā)現(xiàn)真菌和寄生蟲；病灶、腎、肝、腸在透射電鏡下未見病毒粒子。

圖1 患病許氏平鲉體表潰瘍

2.2 致病性驗(yàn)證

感染試驗(yàn)共進(jìn)行10 d，以注射結(jié)束后24 h 計(jì)為1 d。如圖 2 所示，3×107CFU/mL、3×106CFU/mL、3×105CFU/mL 試驗(yàn)組的許氏平鲉均在注射菌液2 d后出現(xiàn)死亡。其中，3×107CFU/mL 組在第4 天全部死亡，3×106CFU/mL 組在第 5 天全部死亡，3×105CFU/mL組在第7 天全部死亡。注射菌液濃度為3×104CFU/mL的試驗(yàn)組，培養(yǎng)4 d 后開始發(fā)現(xiàn)死亡，至試驗(yàn)結(jié)束，累計(jì)70%死亡；菌液濃度為3×103CFU/mL 病死率為30%。從生理活動來看，人工感染后的許氏平鲉游動遲緩、攝食量減少，死亡魚的體表存在出血點(diǎn)和潰瘍，部分還會出現(xiàn)腹水，與自然感染無異。相比之下，空白組和對照組均無死亡和異常。采用劃線接種的方法在TCBS 平板上接種人工感染后發(fā)病的瀕死魚腹水及內(nèi)臟分離菌株，通過形態(tài)和理化特性分析，新分離株和原感染菌株基本一致。利用李長紅等[11]改良的寇氏法，可以得到菌株BN-1910 對許氏平鲉 10 d 的 LD50 為 7.98×103CFU/mL。

圖2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病原菌的形態(tài)觀察

在患病許氏平鲉的病灶中分離出一株優(yōu)勢菌株，命名為BN-1910。對此菌株分離純化，并在28 ℃下使用TSB 瓊脂平板培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)18~24 h 后的菌落形態(tài)，如圖3 所示，可以發(fā)現(xiàn)其直徑多在2 mm 左右，從中央略隆起，表面光滑，呈半透明圓形。該菌株能夠在TCBS 培養(yǎng)基上生長，菌落呈短棒狀，表現(xiàn)為黃色、隆起、邊緣整齊、圓形光滑，革蘭氏染色陰性。

2.4 病原菌理化特征

理化特性見表1。

圖3 菌株在TCBS 平板上的菌落形態(tài)

表1 生化反應(yīng)結(jié)果

注：“＋”表示陽性，“－”表示陰性；“F”表示發(fā)酵；“d”表示結(jié)果為陽性或陰性均有。

2.5 16S rRNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

使用PCR 擴(kuò)增所分離菌株BN-1910 的16S rRNA基因序列，測序后獲得1 449 bp 的DNA 片段。將測序所得序列提交至NCBI 進(jìn)行BLAST 分析，以16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株BN-1910 與哈維氏弧菌聚為一支，置信度99%（圖4）。由以上結(jié)果出發(fā)，可以判斷菌株為哈維氏弧菌。16S rRNA 基因序列與MT864681.1 比對情況如圖5 所示。

圖4 菌株BN-1910 的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖5 16S rRNA 基因序列與MT864681.1 部分比對結(jié)果

2.6 藥敏特性

抗生素敏感性測試的結(jié)果如表2 所示。由表可知，分離菌株對左氧氟沙星、鏈霉素和氟哌酸高度敏感，對氟羅沙星、慶大霉素和卡那霉素中度敏感，對另外八種抗生素不敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖成為捕撈漁民轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)、漁業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的優(yōu)先發(fā)展產(chǎn)業(yè)。許氏平鲉是大連海域常見魚類，本地海洋牧場重點(diǎn)增殖魚類，也是大連市增殖放流品種之一，它已成為我市重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類。近幾年，大連市許氏平鲉養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，集約化程度不斷提高，但疾病防控水平受限，同時(shí)投喂冰鮮餌料存在潛在細(xì)菌污染[12]，許氏平鲉發(fā)病時(shí)有發(fā)生[13]，給養(yǎng)殖企業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

目前日本、韓國許氏平鲉養(yǎng)殖有較多關(guān)于細(xì)菌性疾病報(bào)道，說明細(xì)菌性疾病是影響許氏平鲉網(wǎng)箱養(yǎng)殖的關(guān)鍵因素。這些報(bào)道中涉及的弧菌包括奧氏弧菌（V.ordalii）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnf icus）、溶藻膠弧菌（V.alginolyticus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）等[14]。許氏平鲉受弧菌感染后主要表現(xiàn)有體色發(fā)黑、表皮充血紅腫，游動不規(guī)則，攝食差，嚴(yán)重時(shí)肌肉腐爛，此次金州區(qū)患病魚發(fā)病特征與弧菌病十分相似。本研究通過分離病魚病灶獲得優(yōu)勢菌，并利用感染試驗(yàn)證明其對于許氏平鲉的致病力。從生理生化、形態(tài)特征和16S rDNA 基因序列比對后確定了該菌株為哈維氏弧菌。有報(bào)道表明哈維氏弧菌能感染大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[15]暴發(fā)潰瘍病，病魚出現(xiàn)體表出血、肌肉潰爛、眼球凸出癥狀，部分特征與本研究病魚高度相似。受哈維氏弧菌感染的黑鯛（Sparus macrocephalus）[16]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[4]也出現(xiàn)類似患病特征。哈維氏弧菌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其胞外產(chǎn)物有多種活性酶類物質(zhì)，其中分子量約38 kDa 的蛋白酶對鯽（Carassius auratus）有致死毒性[17]。

藥敏試驗(yàn)表明分離菌株對左氧氟沙星、鏈霉素和氟哌酸高度敏感，對氟羅沙星、慶大霉素和卡那霉素中度敏感。藥敏試驗(yàn)結(jié)果對哈維氏弧菌的防治有參考價(jià)值，患病初期的魚體可嘗試選用氟哌酸、鏈霉素和左氧氟沙星藥浴進(jìn)行防治。疾病的預(yù)防最為主要，黃輝等[18]研究顯示重組哈維氏弧菌外膜蛋白OmpU 具有良好的免疫原性, 可作為亞單位疫苗的開發(fā)對象。