外周血淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子在未足月胎膜早破孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎發(fā)生的相關(guān)性研究

劉會雪，尹紅亞，童重新，何瑞芝，高 芳

胎膜早破(premature rupture of membrane， PROM)是指臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂，是妊娠期常見并發(fā)癥，發(fā)生率為3.3%～21.9%[1]。未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membrane， PPROM)即發(fā)生在妊娠37周前的PROM，是引起圍生期婦女不良妊娠結(jié)局的重要原因[2]。導(dǎo)致PROM及早產(chǎn)的因素較多，其中感染是最主要的原因。絨毛膜羊膜炎即妊娠期宮腔內(nèi)胎兒及其附屬物被病原微生物侵入所致，研究發(fā)現(xiàn)，絨毛膜羊膜炎發(fā)生時，羊水內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平較無感染者顯著升高，故應(yīng)用檢測細(xì)胞因子的方法來早期診斷絨毛膜羊膜炎引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注[3]。此外，T、B淋巴細(xì)胞亞群也是近年來免疫學(xué)研究的熱點，其對感染性疾病的輔助診斷、療效評估及預(yù)后監(jiān)測均有重要意義[4]。本研究就外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子在PPROM孕婦中的水平變化及與絨毛膜羊膜炎發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在為臨床診療提供思路，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2019年12月于本院就診的PPROM孕婦，納入標(biāo)準(zhǔn)：①滿足PROM診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②孕周26～37周；③入院時未臨產(chǎn)，破膜時間<72 h者；④臨床資料完整且真實者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并高血壓病、心臟病、糖尿病等病史；②機械性損傷、心臟病、雙胎、胎位異常等原因所致的PROM者；③入院前7 d內(nèi)應(yīng)用抗菌藥物者；④失訪及實驗室檢查異常者。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)共選取50例為研究組，其中21例并發(fā)絨毛膜羊膜炎為絨毛膜羊膜炎組，29例未并發(fā)絨毛膜羊膜炎為無絨毛膜羊膜炎組。同時選取同期未發(fā)生PROM孕婦50例為對照組。研究組和對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)執(zhí)行。

表1 未足月胎膜早破和未發(fā)生胎膜早破兩組孕婦一般資料比較

1.2研究方法 收集研究對象臨床資料，包括年齡、孕產(chǎn)史、入院時白細(xì)胞計數(shù)、入院時體溫、潛伏期時間(膜破裂至分娩的時間)、羊水過少(羊水量<30 ml)等；檢測兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD56)、B淋巴細(xì)胞亞群(CD19+)和細(xì)胞因子[Th1型細(xì)胞因子γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)，Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6]含量。

1.3檢測方法

1.3.1淋巴細(xì)胞亞群檢測：抽取所有受檢者入組時清晨空腹靜脈血3 ml，置入EDTA-K2抗凝管，3000 r/min離心10 min取上清液。由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格按照說明將標(biāo)準(zhǔn)量的抗體抽取放置于流式管中，加入100 μl已混勻的全血并漩渦混勻放置于避光處15 min，將BD溶血素1.5 ml溶入流式管并于避光處孵育10 min直至完全溶解透亮，磷酸緩沖鹽(PBS)溶液洗滌1次并離心，棄上清液后再次加入PBS溶液洗滌2次，洗滌完成后加入1%固定液600 μl上機待檢。應(yīng)用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.2細(xì)胞因子：抽取所有受檢者入組時清晨空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心10 min取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-6、IFN-γ、TNF-β水平，試劑盒購自美國BD公司。

1.4絨毛膜羊膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]①孕婦體溫>38.0℃，并排除其他感染存在；②孕婦白細(xì)胞計數(shù)≥15×109/L；③孕婦心動過速，心率>100/min，并排除心臟疾病及藥物因素；④胎兒心動過速，胎心基線>160/min，排除臍帶繞頸等因素；⑤子宮壓痛；⑥羊水惡臭。①為基本條件，再合并以上任何1項陽性體征即可診斷為臨床絨毛膜羊膜炎；無明顯臨床癥狀和體征，僅實驗室指標(biāo)異常診斷為亞臨床絨毛膜羊膜炎。

2 結(jié)果

2.1兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子水平比較 研究組CD4+、CD8+、CD19+及IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較對照組高，CD56水平較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 未足月胎膜早破和未發(fā)生胎膜早破兩組孕婦外周血淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平比較

2.2影響PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的單因素分析 兩組年齡、經(jīng)產(chǎn)人數(shù)、入院時白細(xì)胞計數(shù)、入院時體溫比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；絨毛膜羊膜炎組潛伏期時間長于無絨毛膜羊膜炎組，羊水過少人數(shù)多于無絨毛膜羊膜炎組，CD4+、CD8+、CD19+、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較無絨毛膜羊膜炎組高，CD56水平較無絨毛膜羊膜炎組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 影響未足月胎膜早破患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的單因素分析

2.3影響PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的多因素分析 CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平異常及羊水過少是PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素(P<0.05或P<0.01)，見表4。

表4 影響未足月胎膜早破患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的多因素分析

2.4外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子對PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的預(yù)測價值分析 采用ROC曲線分析CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯(lián)合檢測對PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的預(yù)測價值，結(jié)果顯示CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯(lián)合檢測曲線下面積分別0.828、0.878、0.873、0.755、0.900、0.864、0.957、0.999，以聯(lián)合檢測曲線下面積最大，見圖1。提示聯(lián)合檢測對PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的預(yù)測價值最高。

圖1 外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子對未足月胎膜早破患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的受試者工作特征曲線 IL-6為白細(xì)胞介素-6,IFN-γ為γ干擾素，TNF-β為腫瘤壞死因子-β

3 討論

PROM病因較為復(fù)雜，發(fā)病機制尚不十分清楚，可能是多種風(fēng)險因素作用導(dǎo)致的產(chǎn)科并發(fā)癥，如炎癥細(xì)胞因子、營養(yǎng)因素、基因多態(tài)性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[7]。在PROM患者中，絨毛膜羊膜炎的發(fā)生率較高，本研究中50例PPROM患者絨毛膜羊膜炎發(fā)病率為42.00%，與既往研究相似[8]。絨毛膜羊膜炎有著不同的發(fā)展階段。首先，絨毛膜羊膜炎引起母體炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為羊膜腔感染綜合征，稱亞臨床性感染；隨著感染的進(jìn)一步蔓延，引起胎兒炎性反應(yīng)，新生兒感染后易發(fā)生多種并發(fā)癥如新生兒腦損傷等，可危及生命[9]。因此，如何對PROM并發(fā)絨毛膜羊膜炎進(jìn)行早期診斷，選擇最適宜的時機、最合適的途徑終止妊娠，為是否延長孕周提供證據(jù)，對減少母嬰圍生期并發(fā)癥的發(fā)生至為重要[10]。

3.1細(xì)胞因子在PPROM孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎并發(fā)的相關(guān)性 研究認(rèn)為，妊娠成功的必備條件之一是母體與胎兒間的免疫相容[11]。輔助性T(Th)細(xì)胞的功能性分化是免疫學(xué)研究的熱點之一，Th細(xì)胞分化后產(chǎn)生Th1/Th2兩種不同細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)機制也開始用于解釋母胎界面的細(xì)胞調(diào)節(jié)現(xiàn)象[12]。而近年來對Th1/Th2細(xì)胞因子的研究表明：正常妊娠Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢，即妊娠期母體是趨向于Th2型細(xì)胞因子為優(yōu)勢參與的體液免疫，Th1型細(xì)胞因子參與的細(xì)胞免疫則處于劣勢狀態(tài)[13]。一般情況下，Th1和Th2型細(xì)胞分化與功能相互制約，Th1/Th2處于動態(tài)平衡。在某些狀態(tài)下，Th1/Th2的動態(tài)平衡狀態(tài)被打破，而造成偏向Th1或Th2的優(yōu)勢應(yīng)答，進(jìn)而引起感染性疾病、過敏性疾病、病理性妊娠等的發(fā)生[14]。

研究表明，在早產(chǎn)和PROM孕婦羊水、胎盤中均有細(xì)胞因子的異常表達(dá)[15]。Lai等[16]用酶聯(lián)免疫吸附法檢測了早產(chǎn)、PROM組IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12的表達(dá)，結(jié)果Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及IL-1水平在早產(chǎn)、PROM組中顯著增加，而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10在正常妊娠足月婦女中顯著增加，這些數(shù)據(jù)表明在早產(chǎn)、PROM婦女中存在Th1偏移現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，研究組IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較對照組高，且絨毛膜羊膜炎組IL-6、IFN-γ、TNF-β水平較無絨毛膜羊膜炎組高，證明細(xì)胞因子異常與PPROM發(fā)生關(guān)系密切，且參與并發(fā)絨毛膜羊膜炎的炎性過程。而在多因素Logistic分析中顯示，各項細(xì)胞因子異常作為PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素，進(jìn)一步提示分娩前聯(lián)合檢測母血細(xì)胞因子含量，可增加并發(fā)絨毛膜羊膜炎檢出準(zhǔn)確率。

3.2淋巴細(xì)胞亞群在PPROM孕婦中水平變化及與絨毛膜羊膜炎并發(fā)的相關(guān)性 淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞執(zhí)行特異性細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)功能，在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[17]。其中，CD4+和CD8+是T淋巴細(xì)胞亞群重要的組成部分。CD4+具有促進(jìn)B細(xì)胞、T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞增殖與分化的功能；CD8+是抑制免疫應(yīng)答的活化劑，具有細(xì)胞毒作用，可抑制和殺傷T細(xì)胞和靶細(xì)胞，為殺傷性T細(xì)胞。正常情況下，CD4+和CD8+保持一定的比例,當(dāng)二者數(shù)量發(fā)生變化，可導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂和免疫失調(diào)，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而CD56是一組相關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白，在胚胎發(fā)生發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞的相互聯(lián)系中發(fā)揮重要的作用[18]。CD56在子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)，通過計算患者體內(nèi)CD56的數(shù)量，可對其內(nèi)膜免疫狀態(tài)進(jìn)行評估。此外，CD19+為一種簇分化抗原，是B細(xì)胞增殖、分化、活化及抗體產(chǎn)生的重要膜抗原[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組CD4+、CD8+、CD19+、CD56水平在PPROM患者中均顯著異常；同時，絨毛膜羊膜炎組CD4+、CD8+、CD19+水平較無絨毛膜羊膜炎組高，CD56水平較無絨毛膜羊膜炎組低，證明淋巴細(xì)胞亞群在PPROM及絨毛膜羊膜炎的發(fā)病機制中起重要作用。進(jìn)一步利用ROC曲線分析CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β及聯(lián)合檢測對PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的預(yù)測價值，結(jié)果顯示各指標(biāo)曲線下面積以聯(lián)合檢測最大，提示聯(lián)合檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子可作為預(yù)測PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的有效手段。

綜上，外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD56)、B淋巴細(xì)胞亞群(CD19+)及細(xì)胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-β)水平在PPROM患者中異常表達(dá)，其為PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的獨立危險因素，聯(lián)合檢測各指標(biāo)可作為判斷PPROM患者并發(fā)絨毛膜羊膜炎的指標(biāo)。