廣葉繡球菌水溶性多糖結(jié)構(gòu)表征及其對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響

謝 添，郝正祺，常明昌,，孟俊龍,，劉靖宇,，馮翠萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西太谷 030801）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）是一種極珍貴的藥食兩用菌，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，其中，多糖是主要的生物活性成分，含量可達(dá)干質(zhì)量的39.3%～43.6%。多糖組成中以β-葡聚糖含量最高，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[3-5]。有研究表明，廣葉繡球菌多糖可以刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，提高小鼠的先天免疫能力，發(fā)揮抗腫瘤活性[6-7]。另有研究表明，廣葉繡球菌多糖具有一定亞硝酸鹽清除能力以及抑菌、免疫和抗氧化的能力[8-9]。

對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的表征是認(rèn)識(shí)其生物活性的基礎(chǔ)。王萌皓等[10]研究表明，廣葉繡球菌多糖分子質(zhì)量范圍為215 u～393 ku，由摩爾比為13∶4∶1∶2∶3的葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖組成，具有一定清除自由基和促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力。廣葉繡球菌酸性多糖分子質(zhì)量為5.8 ku，由摩爾比為2∶7∶1∶2的半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖組成，具有一定的抗氧化能力[11]。關(guān)于廣葉繡球菌水溶性多糖的結(jié)構(gòu)表征與其功能研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用超聲波輔助水提醇沉法，并經(jīng)分離純化后從廣葉繡球菌子實(shí)體中得到廣葉繡球菌水溶性多糖組分，對(duì)廣葉繡球菌水溶性多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、表觀及分子形貌等進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)研究其對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖活力的影響，旨在為今后廣葉繡球菌水溶性多糖的開(kāi)發(fā)利用提供一定結(jié)構(gòu)信息和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象 廣葉繡球菌子實(shí)體，由山西省清徐縣太和食用菌栽培基地提供。

1.1.2 主要試劑 核糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖等標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大孔樹(shù)脂HZ-830、陰離子交換柱（DEAE-52）纖維素粉末、交聯(lián)葡聚糖凝膠柱（Sephadex-G100）粉末、T-右旋糖酐標(biāo)品（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超聲波細(xì)胞破碎儀（Scientz-1200E）、恒流泵（DHL-ZB）、電腦全自動(dòng)部分收集器（DBS-100A）、冷凍干燥機(jī)（PL-3000）、凝膠色譜柱（TSK-GEL-4000PWXL）、傅里葉變換紅外光譜儀（Tensor27）、紫外分光光度計(jì)（Cary 4000）、凝膠滲透色譜（1200）、離子色譜儀（ICS-3000）、原子力顯微鏡（SPA-300 HV）、掃描電鏡（JSM-6010）、激光粒度分析儀器（WJL-628）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 廣葉繡球菌水溶性多糖的分離純化 參照文獻(xiàn)[9]多糖制備方法，得到廣葉繡球菌水溶性多糖，命名為SLP-a 和SLP-b。

1.2.2 廣葉繡球菌水溶性多糖分子量測(cè)定 其參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定SLP-a 和SLP-b 的分子質(zhì)量。具體色譜條件為：色譜柱；檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器；柱溫為40 ℃；上樣量為20 μL；上樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL；流動(dòng)相為蒸餾水；流速為0.6 mL/min。

1.2.3 廣葉繡球菌水溶性多糖單糖組成測(cè)定 其參照文獻(xiàn)[13]使用離子色譜儀進(jìn)行色譜分析。采用色譜柱Carbopac PA20 柱（2 mm×250 mm）進(jìn)行梯度洗脫：100%200 mmol/LNaOH 0～2 min，10%200 mmol/L NaOH 和90%超純水2.1～20.0 min，100%200 mmol/L NaOH 20.1～40.0 min；采用阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖等作為單糖的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 廣葉繡球菌水溶性多糖特征吸收峰的檢測(cè) 其參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。分別稱取2 mg 的SLP-a和SLP-b，以紅外光譜儀在400～4 000 cm 范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 廣葉繡球菌水溶性多糖表觀形貌觀察 其參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。將2 種凍干后的水溶性多糖SLP-a和SLP-b 粉末，黏于銅質(zhì)樣品臺(tái)，對(duì)樣品表面進(jìn)行噴金，采用掃描電鏡（SEM）觀察其表面的結(jié)構(gòu)。

1.2.6 廣葉繡球菌水溶性多糖分子形貌觀察 參照文獻(xiàn)[15]制備質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的SLP-a 和SLP-b 多糖溶液，過(guò)0.45 μm一次性濾器后，取10 μL多糖稀釋液滴在新鮮剝離的云母片表面上，室溫下干燥過(guò)夜。采用原子力顯微鏡（AFM）觀測(cè)多糖形貌。

1.2.7 廣葉繡球菌水溶性多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖能力的影響 參照文獻(xiàn)[16]采用噻唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖能力。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期巨噬細(xì)胞RAW264.7，培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)后吸去培養(yǎng)基，以不加入多糖的培養(yǎng)基細(xì)胞作為空白對(duì)照，其余組中分別加入含有1.95、3.9、7.812 5、15.625、31.25、62、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 的SLP-a 和SLP-b 的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行清洗，每孔加入20 μL MTT 工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶液，振搖15 min，490 nm 下使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值，以僅含多糖的孔為背景誤差組。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graphpad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t 檢驗(yàn)對(duì)同一濃度下不同處理組與對(duì)照組的顯著性進(jìn)行分析（P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著），所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣葉繡球菌水溶性多糖的分離純化

如圖1 所示，將粗廣葉繡球菌多糖（SLPs）經(jīng)DEAE-52 分離得到的水相組分進(jìn)一步通過(guò)Sephadex-G100 柱分子篩作用后，得到2 個(gè)吸收峰，分別收集后，經(jīng)濃縮、凍干得到2 個(gè)組分的廣葉繡球菌水溶性多糖命名為SLP-a 和SLP-b。

2.2 廣葉繡球菌水溶性多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

由圖2 可知，SLP-a 和SLP-b 的分子質(zhì)量分別分布于6 346 u～125 ku 和217 u～196 ku 的范圍。

2.3 廣葉繡球菌水溶性多糖單糖組成分析

由圖3 可知，SLP-a 由摩爾比為64∶1∶19 的果糖、木糖、甘露糖組成；SLP-b 由摩爾比為12∶1∶6∶3 的葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖組成。

2.4 廣葉繡球菌水溶性多糖特征吸收峰分析

由圖4 可知，SLP-a 和SLP-b 均具有典型的多糖吸收峰，2 種多糖樣品分別在波數(shù)為3 417.75 cm-1和3 385.95 cm-1處出現(xiàn)一寬而鈍的強(qiáng)吸收峰，主要是多糖分子間游離羥基和氨基官能團(tuán)的特征吸收峰，由O-H 和N-H 分別伸縮振動(dòng)引起；分別在波數(shù)為2 927.12 cm-1和2 931.57 cm-1處出現(xiàn)中強(qiáng)的尖峰，是由亞甲基-CH2-中的C-H 伸縮振動(dòng)引起；分別在波數(shù)為1 641.80 cm-1和1 641.25 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，主要是由官能團(tuán)-COOH 或-CO-中的C＝O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；分別在波數(shù)為1 111.95 cm-1和1 100.72 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，主要是吡喃糖環(huán)的C-O-C 和C-O 單鍵的吸收峰。

2.5 廣葉繡球菌水溶性多糖表觀形貌觀察

由圖5 可知，SLP-a 和SLP-b 為簇狀堆積交織結(jié)構(gòu)；在放大300 倍下進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，SLP-b 較SLP-a 可呈現(xiàn)一定更為緊密、集中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.6 廣葉繡球菌水溶性多糖分子形貌觀察

如圖6 所示，在原子力顯微鏡5 μm 下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，SLP-a 分子呈現(xiàn)為少分支及單鏈狀構(gòu)象；SLP-b分子呈現(xiàn)為球形及大小不一短鏈構(gòu)象，在800 nm下進(jìn)一步觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，SLP-a 多糖單鏈的鏈寬和鏈高分別為17.42～35.41 nm 和0.34～0.96 nm；SLP-b多糖單鏈的鏈寬和鏈高分別為27.07～32.56 nm 和0.52～1.36 nm，其中，球形的直徑和高度分別為26.31～60.51 nm 和0.93～3.58 nm。

2.7 廣葉繡球菌水溶性多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 增殖活力的影響

由圖7 可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0～250 μg/mL范圍內(nèi)，SLP-a 和SLP-b 能夠促進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的增殖；當(dāng)SLP-a 質(zhì)量濃度在31.25 μg/mL 時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，且與對(duì)照組相比差異達(dá)極顯著水平（P ＜0.01）；當(dāng)SLP-b 質(zhì)量濃度在15.625 μg/mL 時(shí)，與對(duì)照組相比差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），此時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)針對(duì)廣葉繡球菌水溶性多糖進(jìn)行了分離純化，得到了SLP-a 和SLP-b 這2 種組分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相應(yīng)的表征，結(jié)果表明，SLP-a 和SLP-b 分子質(zhì)量分別為6 346 u～125 ku 和217 u～196 ku；SLP-a 由摩爾比為64∶1∶19 的果糖、木糖、甘露糖組成，SLP-b 由摩爾比為12∶1∶6∶3的葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖組成。SLP-a 分子呈現(xiàn)為少分支及單鏈狀構(gòu)象，SLP-b 分子呈現(xiàn)為球形及大小不一短鏈構(gòu)象；SLP-a 和SLP-b 表觀均為簇狀堆積，交織，結(jié)構(gòu)規(guī)律性不強(qiáng)，具有一定粗糙、緊密、集中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

食用菌多糖發(fā)揮生物活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此，本試驗(yàn)在探討多糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了SLP-a 和SLP-b 促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力，結(jié)果表明，多糖的分子質(zhì)量范圍、單糖組成、構(gòu)象和官能團(tuán)類型等方面與其生物活性密切相關(guān)[17]。通常當(dāng)分子質(zhì)量在100 u～200 ku 的范圍時(shí)，多糖具有良好的生物活性[18-21]。另有研究表明，處于活性分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多糖分子，其水溶性較高，在水中的黏度較低，因而，其基團(tuán)的活性較高，能提高多糖的生物活性[22]。本研究結(jié)果表明，SLP-a 的分子質(zhì)量范圍為6 346 u～125 ku，SLP-b 的分子質(zhì)量范圍為217 u～196 ku，由于本試驗(yàn)提取廣葉繡球菌多糖時(shí)采用超聲波處理，使得部分高分子量多糖組分?jǐn)嗔?，分子質(zhì)量降低，但是仍有部分分子質(zhì)量處于100 u～200 ku 的范圍，可能是由于其具有一定的生物活性并能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的原因。

為了進(jìn)一步探討廣葉繡球菌水溶性多糖的結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系，本研究對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相應(yīng)的表征，研究表明，單糖的類別和比例與其促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力密切相關(guān)，多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖含量較高[23-24]，且具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的單糖組成時(shí)，多糖具有良好的生物活性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，滑子菇多糖的單糖組成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力[25]。本研究中，SLP-a 主要由果糖、木糖和甘露糖組成，SLP-b 主要由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖組成，這可能也是其能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的原因之一。此外，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析可知，多糖分子SLP-a 和SLP-b 中有大量的游離羥基和氨基，且其糖環(huán)為吡喃環(huán)，表明SLP-a 和SLP-b 有較為穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在原子力顯微鏡下觀察可知，廣葉繡球菌水溶性多糖呈現(xiàn)一定的鏈狀分支構(gòu)象，可以對(duì)多糖空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到重要作用。由此可知，SLP-a 和SLP-b 化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)都較為穩(wěn)定，因而可以保證其相對(duì)穩(wěn)定地發(fā)揮生物學(xué)活性。而掃描電鏡結(jié)果顯示，SLP-a 與SLP-b 均表現(xiàn)為一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與基團(tuán)發(fā)生作用時(shí)可擁有更大的接觸面積。雖然本試驗(yàn)中SLP-b 與SLP-a 相比，在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的能力上未有明顯的調(diào)節(jié)趨勢(shì)，但是SLP-b 質(zhì)量濃度在15.625 μg/mL 時(shí)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，而SLP-a 質(zhì)量濃度在31.25 μg/mL時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。對(duì)于二者的結(jié)構(gòu)及其在調(diào)節(jié)其他生物活性上的差異還有待進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)對(duì)SLP-a 和SLP-b 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，且發(fā)現(xiàn)二者在一定濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)能力。但是有關(guān)SLP-a 和SLP-b 高級(jí)立體構(gòu)象與生物活性的研究還未深入，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。