昆蟲性別決定機(jī)制研究進(jìn)展及展望

彭 威，翟宗昭

（蛋白質(zhì)化學(xué)與魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室/淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室/動物腸道功能調(diào)控湖南省重點實驗室/湖南省動物腸道生態(tài)與健康國際科技創(chuàng)新合作基地，湖南師范大學(xué)，長沙 410081）

長期以來，性別決定的調(diào)控和進(jìn)化是發(fā)育和進(jìn)化生物學(xué)研究的一個重大問題。性別決定是物種進(jìn)化選擇的結(jié)果，也是生物生命活動的基本特征。昆蟲性別決定機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性，即使在相近的物種之間甚至是相同物種的不同種群間都存在不同的性別決定機(jī)制[1-4]。昆蟲中普遍的性別決定模式是，早期胚胎性別決定原始信號（primary signal）激活性別決定級聯(lián)基因特異性剪切，級聯(lián)基因性別特異性產(chǎn)物調(diào)控個體分化為雄性或者雌性；缺少原始信號導(dǎo)致默認(rèn)的基因剪切模式調(diào)控相反的性別發(fā)育[5-7]。在昆蟲性別決定機(jī)制的進(jìn)化過程中，性別決定級聯(lián)底層基因高度保守，而性別決定原始信號多變[8,9]。性別決定原始信號主要有X染色體相連的信號元素（X chromosome-linked signal elements，XSE）、雄性決定因子（Male determiner factor，M-factor）、基因的純合性或雜合性、piwi-interacting RNA（piRNA）等。性別決定原始信號調(diào)控關(guān)鍵基因transformer（tra）雌雄差異性表達(dá)，tra產(chǎn)物和transformer-2（tra-2）基因通過性別特異選擇性剪切機(jī)制實現(xiàn)底層雙性基因doublesex（dsx）雌雄特異表達(dá)，繼而調(diào)控雌雄發(fā)育相關(guān)基因在兩性中的表達(dá)，實現(xiàn)雌雄性別分化。昆蟲性別決定級聯(lián)基因如tra和dsx通過性別特異選擇性剪切方式調(diào)控自身表達(dá)，進(jìn)而傳遞性別發(fā)育信號。本文介紹了昆蟲性別決定關(guān)鍵基因tra、tra-2和底層保守基因dsx的概況，對不同昆蟲性別決定原始信號及其性別決定調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了綜述，以期為靶標(biāo)昆蟲性別決定的害蟲不育防治技術(shù)提供理論支持。

1 昆蟲性別決定原始信號及其調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

昆蟲具有多種機(jī)制決定性別，其性別決定原始信號差異巨大（圖1）。早期胚胎性別決定原始信號激活級聯(lián)基因性別特異選擇性剪切，級聯(lián)基因性別特異產(chǎn)物調(diào)控個體分化為雄性或者雌性。雙翅目模式物種黑腹果蠅Drosophila melanogaster是XX/XY染色體性別決定系統(tǒng)，其性別決定通過XSE＞Sex lethal（Sxl）＞tra/tra-2＞dsx級聯(lián)基因調(diào)控。雌性個體雙倍劑量的XSE作為性別決定原始信號啟動Sxl基因表達(dá)，SXL蛋白調(diào)控tra基因mRNA前體（pre-mRNA）雌性特異選擇性剪切產(chǎn)生功能TRA蛋白，TRA蛋白和輔助因子TRA-2蛋白共同促進(jìn)dsx基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切，雌性特異DSXF蛋白指導(dǎo)雌性分化。雄性個體單倍劑量的XSE不足以啟動Sxl基因的表達(dá)，tra基因pre-mRNA在缺少SXL蛋白的情況下進(jìn)行雄性特異選擇性剪切，產(chǎn)生無功能TRA蛋白，進(jìn)而調(diào)控dsx基因pre-mRNA產(chǎn)生雄性特異DSXM蛋白，促進(jìn)雄性分化（圖1）[10-13]。

雙翅目昆蟲家蠅Musca domestica和地中海實蠅Ceratitis capitata是XX/XY染色體性別決定系統(tǒng)，Y染色體相連的雄性決定因子（M-factor）是性別決定的原始信號。其性別決定通過M-factor＞tra/tra-2＞dsx級聯(lián)基因調(diào)控，Sxl基因不參與家蠅和地中海實蠅性別決定。其性別決定由雄性決定基因male determiner（Mdmd）和Maleness-on the-Y（MoY）存在與否決定。XY雄性胚胎中父本繼承的Mdmd基因和MoY基因阻止合子中母本tra基因的活化，dsx基因pre-mRNA在缺少TRA蛋白下進(jìn)行雄性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雄性特異DSXM蛋白，進(jìn)而實現(xiàn)雄性性別決定和分化。XX雌性胚胎缺少Mdmd基因和MoY基因，來源于合子中的母本tra基因建立正反饋自動調(diào)控循環(huán)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生功能TRA蛋白，TRA蛋白和輔助因子TRA-2蛋白共同指導(dǎo)dsx基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雌性特異DSXF蛋白，完成雌性性別決定和分化（圖 1）[14,15]。地中海實蠅雄性決定基因MoY同時也是橘小實蠅Bactrocera dorsalis和橄欖果實蠅Bactrocera oleae的性別決定原始信號，其功能具有保守性[15]。

雙翅目昆蟲蚊子的性別決定原始信號是雄性決定因子（M-factor），由于蚊子缺少tra同源基因，其性別決定通過M-factor＞dsx級聯(lián)基因調(diào)控，雄性決定基因直接調(diào)控底層保守基因dsx的表達(dá)。埃及伊蚊Aedes aegypti、岡比亞按蚊Anopheles gambiae和斯氏按蚊Anopheles stephensi雄性決定基因分別是Nix、Yob和Guy1，三者在雄性胚胎早期轉(zhuǎn)錄表達(dá)，不具有序列同源性。Nix、Yob和Guy1基因調(diào)控dsx基因pre-mRNA雄性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雄性特異DSXM蛋白，實現(xiàn)雄性性別發(fā)育。雌性個體缺少Nix、Yob和Guy1基因，導(dǎo)致dsx基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雌性特異DSXF蛋白，從而實現(xiàn)雌性性別發(fā)育（圖1）[16-18]。埃及伊蚊雄性染色體缺少 Y染色體，其雄性決定基因Nix位于 1號染色體的非重組區(qū)域，Nix基因不調(diào)控劑量補(bǔ)償。岡比亞按蚊和斯氏按蚊雄性決定基因Yob和Guy1不僅調(diào)控雄性性別決定，而且通過上調(diào)雄性單條X染色體上的基因表達(dá)量來實現(xiàn)劑量補(bǔ)償。

膜翅目是單倍二倍體性別決定系統(tǒng)：雄性是從未受精卵發(fā)育而來的單倍體，只繼承到母本的基因組；而雌性是從受精卵發(fā)育來的雙倍體，繼承到父本和母本的基因組。膜翅目昆蟲性別決定機(jī)制主要是補(bǔ)償型性別決定機(jī)制，如意蜂Apis mellifera，其性別決定的原始信號是complementary sex determiner（csd）基因的純合性或雜合性，其性別決定通過csd＞fem＞dsx級聯(lián)基因調(diào)控[19-21]。雌性個體中來源于雜合的csd基因產(chǎn)生功能Csd蛋白，指導(dǎo)feminizer（fem）基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切，產(chǎn)生功能Fem蛋白，F(xiàn)em蛋白調(diào)控dsx基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雌性特異DSXF蛋白，推動雌性發(fā)育。fem基因是tra基因的同源基因。雄性個體中來源于純合子或半合子的csd基因產(chǎn)生無功能Csd蛋白，導(dǎo)致fem基因pre-mRNA雄性特異選擇性剪切，產(chǎn)生無功能Fem蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致dsx基因pre-mRNA雄性特異選擇性剪切，產(chǎn)生雄性特異DSXM蛋白，推動雄性發(fā)育（圖1）。最近，在麗蠅蛹集金小蜂Nasonia vitripennis中鑒定出性別決定基因wasp overruler of masculinization（wom），wom從父本提供的基因組中轉(zhuǎn)錄至受精卵中，以啟動雌性發(fā)育。而wom母源沉默導(dǎo)致單倍體胚胎雄性發(fā)育[22]（圖1）。

鱗翅目物種表現(xiàn)出與雙翅目、膜翅目等昆蟲顯著不同的性別決定系統(tǒng)，家蠶Bombyx mori是ZW性染色體系統(tǒng)，雄性是ZZ型，而雌性是ZW型[23]。來自于W染色體的一種雌特異fempiRNA是家蠶性別決定的原始信號，其性別決定通過fempiRNA＞Masc＞dsx級聯(lián)基因調(diào)控。fempiRNA通過抑制來自于Z染色體Masculinizer（Masc）基因的表達(dá)，導(dǎo)致家蠶dsx基因pre-mRNA在缺少Masc蛋白和PSI蛋白下進(jìn)行雌特異選擇性剪切，產(chǎn)生雌性特異DSXF蛋白，從而實現(xiàn)雌性發(fā)育。雄性個體缺少fempiRNA，MascmRNA正常表達(dá)，家蠶dsx基因pre-mRNA在Masc蛋白和PSI蛋白指導(dǎo)下進(jìn)行雄特異性選擇性剪切，產(chǎn)生雄性特異DSXM蛋白，實現(xiàn)雄性發(fā)育（圖1）[24]。在家蠶性別決定途徑中，PSI基因通過結(jié)合dsx基因pre-mRNA雌性特異外顯子上的CE1序列來調(diào)控dsx雄性特異選擇性剪切。Imp基因通過增加PSIRNA結(jié)合能力提高dsx基因pre-mRNA雄性特異選擇性剪切。PSI和Imp蛋白與已知的Ser/Arg（SR）蛋白，如TRA和TRA-2不具有序列相似性。

圖1 昆蟲性別決定機(jī)制Fig. 1 Sex determination mechanism in insects

2 昆蟲性別決定底層基因doublesex概況

Dsx基因是昆蟲性別級聯(lián)系統(tǒng)中的底層基因，其結(jié)構(gòu)和功能在不同昆蟲中具有保守性，調(diào)控軀體性別分化[25,26]。不同昆蟲編碼的DSX蛋白主要包括兩部分：共同的氨基端（N端）與雌雄特異的羧基端（C端）。N端包含一個能與DNA結(jié)合的保守基序DM（doublesexandmab-3）結(jié)構(gòu)域，由 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）和寡聚化結(jié)構(gòu)域（OD1）組成，是一種由半胱氨酸和組氨酸組成的鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域是 DSX蛋白與下游靶標(biāo)基因結(jié)合的重要位點，而C端雌雄特異的OD2結(jié)構(gòu)域激活或者抑制下游靶標(biāo)基因的表達(dá)[27-32]。dsx基因在昆蟲中通過自身可變剪切產(chǎn)生雌雄特異DSX蛋白（DSXF和DSXM蛋白），DSXF通過激活雌性發(fā)育相關(guān)基因和抑制雄性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控雌性個體的發(fā)育，而DSXM通過激活雄性相關(guān)基因和抑制雌性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控雄性個體的發(fā)育[2,33]。目前為止，dsx同源基因已在不同昆蟲中得到鑒定，如雙翅目黑腹果蠅、家蠅、銅綠蠅Lucilia cuprina、昆士蘭實蠅Bactrocera tryoni、橄欖果實蠅、地中海實蠅、橘小實蠅、西印度按實蠅Anastrepha obliqua、埃及伊蚊、岡比亞按蚊、尖眼蕈蚊Sciara coprophila[34-46]；膜翅目意蜂、菜葉蜂Athalia rosae、麗蠅蛹集金小蜂、紅火蟻Solenopsis invicta和灰黑心結(jié)蟻Cardiocondyla obscurior[19,47-50]；鱗翅目家蠶、玉帶鳳蝶Papilio polytes、斜紋夜蛾Spodoptera litura[51-56]；鞘翅目赤擬谷盜Tribolium castaneum、食糞金龜Onthophagus taurus、雙叉犀金龜Trypoxylus dichotomus和美他力弗細(xì)身赤鍬甲Cyclommatus metallifer[57-62]；半翅目煙粉虱Bemisia tabaci和褐飛虱Nilaparvata lugens[63,64]。大部分昆蟲dsx基因pre-mRNA上存在由13個核苷酸組成的重復(fù)元件（dsxRE），雌性個體中TRA蛋白和TRA-2蛋白組成SR剪切因子作用于dsxRE，調(diào)控dsx基因pre-mRNA雌性特異選擇性剪切產(chǎn)生一種雌性特異DSXF蛋白。而雄性個體由于缺少功能TRA蛋白，TRA-2蛋白不能結(jié)合dsxRE，從而導(dǎo)致dsx基因pre-mRNA進(jìn)行默認(rèn)的雄性特異選擇性剪切產(chǎn)生一種雄性特異DSXM蛋白[65]。在其他昆蟲如家蠅、意蜂、家蠶、埃及伊蚊和赤擬谷盜中dsx基因mRNA前體經(jīng)過雌雄特異性選擇剪切產(chǎn)生多個DSXF蛋白或者DSXM蛋白[36,43,47,66]。另外，一些昆蟲通過調(diào)控dsx基因性別特異剪切體在雌雄個體中的差異表達(dá)，參與調(diào)控雌雄性別分化。如尖眼蕈蚊dsx基因可產(chǎn)生四個無性別特異性的可變剪切體，但其表達(dá)水平具有性別特異性[46]。灰黑心結(jié)蟻中dsx基因產(chǎn)生的剪切體不僅在雌雄個體中具有性別特異表達(dá)模式，而且在不同型個體中也具有特異的表達(dá)模式[48]。煙粉虱dsx基因可產(chǎn)生28個可變剪切體，其中16個剪切體編碼14種DSX蛋白，其表達(dá)量在雌雄個體中具有差異性[63]。

Dsx基因在不同昆蟲性別決定和分化中的功能具有保守性，參與包括雌雄軀體性別分化、外生殖器的形成、求偶行為、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等調(diào)控[58,67-70]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)異源過表達(dá)dsx基因或者利用RNAi技術(shù)干擾dsx基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)DSXF和DSXM蛋白不僅結(jié)構(gòu)保守且功能也同樣保守。如家蠅和黑腹果蠅雄蟲異源表達(dá)家蠅DSXF蛋白能夠激活卵黃蛋白原vitellogenin基因的表達(dá)，而黑腹果蠅雌蟲異源表達(dá)家蠅DSXM蛋白導(dǎo)致其后背板上形成類似雄性特異的色素沉積[36]。黑腹果蠅雌蟲異源表達(dá)地中海實蠅DSXM蛋白導(dǎo)致雌性軀體和生殖細(xì)胞系部分雄性化[40]。黑腹果蠅雙性個體過表達(dá)西印度按實蠅DSXF和DSXM蛋白誘導(dǎo)雙性個體雌性和雄性性別分化，過表達(dá) DSXF蛋白個體中卵黃蛋白基因yolk protein表達(dá)量增加，而過表達(dá)DSXM蛋白個體中yolk protein表達(dá)量降低[71]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在雄性家蠶中異源表達(dá)dsxf能夠激活雌性特異基因vitellogenin和storage protein的表達(dá)[52]，而在雌性家蠶中異源表達(dá)dsxm導(dǎo)致雌性生殖器部分雄性化[72]。Chen等[41]利用RNAi技術(shù)干擾橘小實蠅dsxf表達(dá)導(dǎo)致yolk protein表達(dá)量和雌蟲繁殖能力受到抑制。干擾赤擬谷盜dsx基因影響卵母細(xì)胞發(fā)育，雌蟲產(chǎn)卵量和卵孵化率下降[58]。通過siRNA介導(dǎo)的方法干擾埃及伊蚊dsx基因表達(dá)，導(dǎo)致雌成蟲雌性特異形態(tài)、生理和行為等方面的特征被破壞，其卵巢變小和生殖力下降等[45]。Xu等[70]通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除家蠶dsxm表達(dá)，突變雄蟲外生殖器出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，且失去交配能力，導(dǎo)致雄性家蠶不育。Guo等[63]沉默煙粉虱dsx基因能夠降低雌蟲vitellogenin基因表達(dá)，同時導(dǎo)致雄蟲外生殖器畸形。不同昆蟲DSXF和DSXM蛋白調(diào)控靶標(biāo)基因表達(dá)是相互拮抗的，如黑腹果蠅DSXF蛋白促進(jìn)yolk protein和腹部性別特異色素沉積bric-a-brac基因表達(dá)，而DSXM抑制yolk protein和bric-a-brac表達(dá)[73-75]。美他力弗細(xì)身赤鍬甲Cyclommatus metalliferDSXF通過降低對保幼激素的敏感性抑制下頜骨的生長，而 DSXM則是通過增強(qiáng)對保幼激素的敏感性促進(jìn)下頜骨的生長[60]。玉帶鳳蝶Papilio polytes雌性個體翅和軀體中dsx亞型不同，其表達(dá)與成蟲翅型高度關(guān)聯(lián)，可能是上游基因調(diào)控dsx時空表達(dá)差異從而實現(xiàn)不同的翅擬態(tài)形式[54]。最近的研究表明dsx基因可能參與社會性昆蟲品級分化，如敲除意蜂dsx基因后工蜂yolk protein表達(dá)量降低、卵巢發(fā)育減緩和信息素生育信號合成受阻，且dsx基因還參與蜂王幼蟲的發(fā)育[76]。另外，在CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除家蠶dsx基因的品系中，信息素受體OR1基因表達(dá)量顯著降低，導(dǎo)致家蠶對信息素性誘醇的感知能力下降和雄性家蠶求偶行為受阻，這是首次在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)dsx基因調(diào)控信息素受體通路[77]。

3 昆蟲性別決定關(guān)鍵基因transformer概況

Tra基因在包括雙翅目、膜翅目、鞘翅目昆蟲中高度保守，在性別決定級聯(lián)系統(tǒng)中調(diào)控底層基因dsx的可變剪切參與性別決定和分化[78,79]。tra的同源基因已在黑腹果蠅[80]、地中海實蠅[81]、橄欖果實蠅[82]、西印度按實蠅[83]、銅綠蠅[84]、家蠅[85]、加勒比按實蠅[86]、赤擬谷盜[87]、麗蠅蛹集金小蜂[88]、對旋麗蠅Cochliomyia hominivorax[88]、螺旋錐蠅Cochliomyia macellaria[88]、絲光麗蠅Lucilia sericata[88]、昆士蘭實蠅[89]、扎氏果實蠅Bactrocera jarvisi[89]、橘小實蠅[90,91]、番石榴實蠅Bactrocera correcta[92]和瓜實蠅Bactrocera cucurbitae[93]中鑒定出來，其剪切方式和功能具有保守性。不同昆蟲tra基因pre-mRNA都含有雄性特異外顯子，其包含使轉(zhuǎn)錄提前停止的終止密碼子。雄蟲中pre-mRNA雄性特異選擇性剪切產(chǎn)物tram翻譯產(chǎn)生短的、無功能蛋白，在性別決定調(diào)控中并不起作用。雌蟲中pre-mRNA雄性特異外顯子被剪切掉，其產(chǎn)物traf翻譯產(chǎn)生功能TRA蛋白。盡管昆蟲中tra基因核苷酸序列和氨基酸組分差異較大，但是作為dsx基因性別特異性剪切調(diào)控因子的功能是保守的。一方面，功能TRA蛋白和TRA-2蛋白結(jié)合dsx基因pre-mRNA上TRA/TRA-2結(jié)合位點指導(dǎo)其雌性特異選擇性剪切，翻譯產(chǎn)生DSXF蛋白。另一方面，功能TRA蛋白和TRA-2蛋白結(jié)合tra基因pre-mRNA上TRA/TRA-2結(jié)合位點啟動一個自動反饋調(diào)控回路，從而實現(xiàn)traf的自我調(diào)控和雌性性別發(fā)育[71,94,95]。在地中海實蠅、橄欖果實蠅、銅綠蠅、家蠅、加勒比按實蠅、赤擬谷盜、對螺麗蠅、螺旋錐蠅、絲光麗蠅、昆士蘭實蠅、橘小實蠅、番石榴實蠅胚胎發(fā)育早期干擾tra基因表達(dá)導(dǎo)致XX雌性個體出現(xiàn)不同程度雄性化（XX假雄性），而雄性個體發(fā)育沒有受到影響[20,81,82,84-88,90-92,96]。最近的研究表明，黑腹果蠅tra基因通過刺激腦中胰島素生成細(xì)胞分泌胰島素類多肽來促進(jìn)脂肪體生長，調(diào)控幼蟲身體大小，這表明tra基因在性別決定和胰島素信號通路中的功能具有相關(guān)性[97]。

Tra同源基因在雙翅目、膜翅目和鞘翅目昆蟲中都有發(fā)現(xiàn)，在鱗翅目中卻沒有鑒定到tra同源基因。在家蠶中，不僅沒有發(fā)現(xiàn)tra同源基因，而且dsx基因上也缺乏dsxRE結(jié)合位點[23,51,98]。膜翅目意蜂tra同源基因已被發(fā)現(xiàn)，命名為fem。其雌性特異剪切產(chǎn)物femf編碼FEM蛋白與其他昆蟲如黑腹果蠅、地中海實蠅和家蠅traf編碼的TRA蛋白擁有相同的精氨酸/絲氨酸（Arg/Ser）和脯氨酸（Pro）區(qū)域，調(diào)控下游dsx基因性別特異選擇性剪切。雄性特異剪切產(chǎn)物femm含有終止密碼子使其編碼短的、無功能蛋白[19,21]。tra序列在不同昆蟲中差異較大，表明tra主要表現(xiàn)為功能保守而非結(jié)構(gòu)保守。根據(jù)TRA蛋白序列進(jìn)行的物種種系進(jìn)化關(guān)系比對發(fā)現(xiàn)tra進(jìn)化遵循種系差異，證明其功能保守而非序列保守。對昆蟲TRA同源基因的比對發(fā)現(xiàn)脯氨酸和精氨酸/絲氨酸富集區(qū)域高度保守，反映其作為性別調(diào)控剪切因子的功能保守性[78]。不同昆蟲通過多種多樣的性別決定原始信號調(diào)控tra基因性別特異選擇性剪切，如雄性決定因子（M-factor），其對雄性發(fā)育是必須的，且主動或被動地抑制tra基因的激活表達(dá)[14-18,99]。XY個體父本繼承的M-factor抑制tra的激活，導(dǎo)致其被剪切成一個含有終止密碼子的雄性特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物tram，進(jìn)而翻譯成一個短的無功能蛋白。性別決定級聯(lián)下游基因dsx在缺少TRA蛋白下進(jìn)行雄性特異選擇性剪切，實現(xiàn)雄性發(fā)育。而XX個體缺少M-factor，母本tra基因雌性特異剪切產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物traf，翻譯產(chǎn)生功能TRA蛋白，進(jìn)而調(diào)控dsx基因雄性特異選擇性剪切，實現(xiàn)雄性發(fā)育。在膜翅目如麗蠅蛹集金小蜂中，受精卵中早期合子啟動父本來源的wom基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，啟動tra基因的自動調(diào)控回路，產(chǎn)生功能TRA蛋白，進(jìn)而調(diào)控dsx基因雌性特異選擇性剪切，實現(xiàn)雌性發(fā)育。未受精卵中缺少wom基因，無法啟動tra自動反饋調(diào)控回路，dsx基因進(jìn)行雄性特異選擇性剪切，實現(xiàn)雄性發(fā)育。和雙倍體性別決定系統(tǒng)相反，單倍二倍體性別決定系統(tǒng)中父本提供的wom基因啟動二倍體雌性發(fā)育，且主動或被動地促進(jìn)tra基因的激活[22,100,101]。

4 昆蟲性別決定關(guān)鍵基因transformer-2概況

Tra-2基因是性別決定級聯(lián)中的關(guān)鍵基因，參與tra調(diào)控dsx基因性別特異選擇性剪切。tra-2同源基因已在黑腹果蠅[102]、家蠅[103]、家蠶[104]、銅綠蠅[84]、地中海實蠅[105]、西印度實蠅[106]、尖眼蕈蚊[107]、意蜂[108]、赤擬谷盜[109]、橘小實蠅[90,91]、麗蠅蛹集金小蜂[110]、斑翅果蠅[111]、南瓜實蠅Bactrocera tau[112]、白紋伊蚊Aedes albopictus[113]中鑒定出來。這些昆蟲tra-2基因編碼的蛋白都包含三個結(jié)構(gòu)域：RNA識別結(jié)構(gòu)域（RNA Recognition Motif，RRM）和兩個絲氨酸/精氨酸結(jié)構(gòu)域（serine/arginine，SR），其中RRM能夠和Tra蛋白結(jié)合形成Tra/Tra-2復(fù)合物，參與dsx基因性別特異選擇性剪切[114-116]。TRA-2蛋白氨基酸序列長度各異，但 RRM 結(jié)構(gòu)域相對保守，由兩個核糖核蛋白域（ribonucleoprotein domain，RNP）或 RNA結(jié)合域（RNA-binding domain，RBD）組成[117]。不同昆蟲tra-2基因的可變剪切體數(shù)量不一，如黑腹果蠅tra-2基因具有四個可變剪切體，其中三個可變剪切體在雌雄個體中都有表迖，一個可變剪切體是雄性特異的[102]。家蠶和意蜂tra-2基因具有6個可變剪切體，麗蛹集金小蜂有4個可變剪切體，赤擬谷盜有3個可變剪切體，但以上昆蟲tra-2可變剪切體都不是雌雄特異性表達(dá)[104,108,110,118]。在家蠅、銅綠蠅、橘小實蠅、地中海實蠅、西印度實蠅等昆蟲中，tra-2基因只有一種可變剪切體[84,90,91,103,105,106]。黑腹果蠅TRA-2蛋白通過RRM和SR結(jié)構(gòu)域與dsxpre-mRNA上的dsxRE位點結(jié)合，并與Tra蛋白組成Tra/Tra-2剪切調(diào)控復(fù)合物，調(diào)控dsx基因雌性特異可變剪切[67]。另外，黑腹果蠅tra-2基因作用于精子形成關(guān)鍵基因alternative testis transcripts和exuperantia，參與雄蟲精子和生殖能力的形成[119-121]。在其他雙翅目如家蠅、地中海實蠅、加勒比按實蠅等昆蟲中，tra-2基因參與tra基因的自我調(diào)控和dsx基因雌性特異可變剪切。胚胎期敲除家蠅、地中海實蠅和加勒比按實蠅tra-2基因表達(dá)，產(chǎn)生具有生殖能力的XX基因型雄蟲和具有兩性特征的成蟲。另外，tra-2還調(diào)控家蠅和地中海實蠅雄蟲的交配行為[103,105,122,123]。膜翅目意蜂和麗蛹集金小蜂胚胎干擾tra-2基因表達(dá)導(dǎo)致dsx基因雄性特異可變剪切（dsxm）的出現(xiàn)和胚胎的大量死亡，表明膜翅目tra-2基因不僅參與調(diào)控dsx雌雄特異可變剪切，而且影響胚胎發(fā)育[108,110,124]。鱗翅目家蠶胚胎期干擾tra-2基因表達(dá)不能引起dsx雌性特異可變剪切和雌性性別的改變，而利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除tra-2導(dǎo)致胚胎死亡。此外，tra-2基因參與雄性家蠶精巢發(fā)育[118,125]。鞘翅目赤擬谷盜tra-2基因參與tra基因自我調(diào)控和dsx基因性別特異可變剪切調(diào)控，且tra-2在赤擬谷盜胚胎和幼蟲發(fā)育中起著重要作用[109]。

5 展望

近年來分子遺傳學(xué)的發(fā)展使人們對于性別決定系統(tǒng)的進(jìn)化有了初步的了解。但昆蟲性別決定機(jī)制豐富多樣，不僅不同昆蟲通過不同的基因和調(diào)控機(jī)制決定性別分化，甚至在同種昆蟲不同品系之間性別決定機(jī)制也不盡相同。通過更多昆蟲性別決定機(jī)制的比較研究，可以為探索物種性別分化通路上類似基因的功能以及確定新的性別決定基因提供參考，對揭示物種的進(jìn)化關(guān)系具有十分重要的意義。這些將為最終建立不依賴輻射的昆蟲不育技術(shù)（sterile insect technique，SIT）提供理論和實踐基礎(chǔ)，突破傳統(tǒng)SIT在生產(chǎn)實踐中的限制。傳統(tǒng)昆蟲不育技術(shù)的主要策略是通過大量人工飼養(yǎng)靶標(biāo)害蟲，經(jīng)過輻射處理后，連續(xù)釋放不育雄性個體，與野生靶標(biāo)雌性害蟲個體交配，產(chǎn)生不育后代，將靶標(biāo)害蟲種群數(shù)量控制在經(jīng)濟(jì)閾值之下，甚至徹底根除靶標(biāo)害蟲。但傳統(tǒng)的SIT由于使用輻照技術(shù)造成雄蟲在野外生存能力和交配競爭力降低，而且在釋放過程中缺乏有效的雌雄分離手段，因此在害蟲防治中有諸多限制。而通過靶標(biāo)昆蟲性別決定構(gòu)建轉(zhuǎn)基因性別品系的SIT將極大提高害蟲的防治和治理。首先，昆蟲性別決定級聯(lián)基因功能研究表明tra和dsx基因在調(diào)控雌雄性別決定和分化中功能保守，胚胎期干擾或敲除其表達(dá)導(dǎo)致后代出現(xiàn)雄性化。因此，可以利用性別決定級聯(lián)基因構(gòu)建雌蟲雄性化轉(zhuǎn)基因性別品系。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種操作簡單，高效精確的基因組編輯技術(shù)，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除性別決定級聯(lián)基因可以實現(xiàn)雌蟲雄性化。而基于CRISPR/Cas9的基因驅(qū)動（gene drive）系統(tǒng)能夠?qū)⑻囟ǖ耐蛔冃誀羁焖贁U(kuò)散到整個種群中，如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶標(biāo)岡比亞按蚊dsx基因?qū)е麓菩约兒贤蛔凅w具有雙性表型且完全不育，同時不會影響雄性發(fā)育和可育性。進(jìn)一步通過基因驅(qū)動系統(tǒng)能夠逐漸減少雌蚊產(chǎn)卵量直至種群數(shù)量崩潰[126]。因此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立昆蟲雄性化的基因驅(qū)動轉(zhuǎn)基因品系，靶標(biāo)性別決定級聯(lián)基因如tra和dsx導(dǎo)致后代雌蟲雄性化，并通過釋放競爭力更強(qiáng)的不育雄蟲后代，能夠提高昆蟲不育技術(shù)對害蟲的防治。其次，性別決定關(guān)鍵基因tra在雌雄中存在不同的剪切模式，tra經(jīng)過選擇性剪切產(chǎn)生雄性特異和雌性特異亞型，雌性特異亞型能翻譯成功能TRA蛋白，而雄性特異亞型由于終止密碼子的存在不能翻譯成功能TRA蛋白。因此，利用tra基因的選擇性剪切可以用于實現(xiàn)雌蟲特異性致死。將含有內(nèi)部終止密碼子的雄性特異tra序列插入到四環(huán)素抑制系統(tǒng)序列中，然后將其整合到昆蟲基因組中即可構(gòu)建雌性特異致死轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。tra雄性特異剪切產(chǎn)物含有終止密碼子，導(dǎo)致四環(huán)素系統(tǒng)不會表達(dá)，因而雄蟲不會致死；tra雌性特異剪切產(chǎn)物不包含終止密碼子，啟動四環(huán)素抑制系統(tǒng)的表達(dá)，導(dǎo)致雌性致死。雌性特異致死系統(tǒng)已在多種昆蟲得到應(yīng)用，如家蠶、棉紅鈴蟲Pectinophora gossypiella、地中海實蠅等[127-130]。最后，昆蟲雄性決定因子調(diào)控雄性化活動及發(fā)育。因此，通過測序技術(shù)對性別決定因子所在的Y染色體進(jìn)行分析，將促進(jìn)其特有結(jié)構(gòu)和雄性性別決定因子的發(fā)現(xiàn)。對不同性別決定機(jī)制中Y染色體序列比較分析，可以研究不同性別決定機(jī)制在演化過程中的起源及轉(zhuǎn)變。近年來相繼在埃及伊蚊、岡比亞按蚊、斯氏按蚊、家蠅和地中海實蠅中鑒定出雄性性別決定基因Nix、Yob、Guy1、Mdmd和MoY，極大豐富和完善了昆蟲性別決定調(diào)控分子機(jī)制[14-18]。通過調(diào)控性別決定基因的表達(dá)從而改變昆蟲性別，使其性別分化向著有利于人類的方向發(fā)育，如全部產(chǎn)生雄性后代，使害蟲種群不能繁衍，發(fā)展不依賴輻射處理的不育防治技術(shù)；或全部產(chǎn)生雌性后代，擴(kuò)大害蟲天敵的種群數(shù)量，為害蟲天敵的遺傳改良提供有效途徑。特別是發(fā)展基于CRISPR/Cas9基因驅(qū)動系統(tǒng)的遺傳改造性別品系，將加快害蟲遺傳調(diào)控和不育防治技術(shù)的發(fā)展。