靈芝孢子粉廢料中粗多糖提取工藝的研究

賈紅巖,王晨光,張　忠,周　瑾,周　帥,張勁松,唐慶九,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.國家食用菌工程技術研究中心,農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,上海 201403;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201403)

?

靈芝孢子粉廢料中粗多糖提取工藝的研究

賈紅巖1,2,王晨光3,張忠2,周瑾3,周帥2,張勁松2,唐慶九2,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.國家食用菌工程技術研究中心,農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,上海 201403;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201403)

為探究脫油后靈芝孢子粉廢料的再利用價值,對其中的粗多糖的提取工藝進行優(yōu)化。以單因素實驗結果為基礎,以液料比、提取溫度、提取時間為自變量,粗多糖得率為響應值,采用Box-Behnken實驗設計方案,研究各自變量及其交互作用對粗多糖得率的影響,提取溫度與液料比、提取溫度與提取時間交互作用較明顯,液料比與提取時間交互作用相對不明顯;并確定靈芝孢子粉廢料粗多糖提取的理論最佳條件為液料比25.00∶1,提取溫度100.00 ℃,提取時間3.00 h,在此條件下粗多糖理論得率達13.320%。實際提取條件為液料比25∶1,提取溫度100 ℃,提取時間3 h,實測值為13.204%,理論值與實測值誤差小于1%。利用響應面方法優(yōu)化的工藝參數(shù)可用于靈芝孢子粉廢料粗多糖的提取,獲得最大得率。

靈芝孢子粉廢料,粗多糖,響應曲面法,提取工藝

靈芝(Ganodermalingzhi)[1-2]是擔子菌門傘菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌[1],在我國已有數(shù)千年的歷史。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明,靈芝用于治療肝病,腎病、高血壓、高血脂、神經衰弱、心血管疾病以及抗腫瘤等都有良好的臨床療效[3]。靈芝孢子(Ganodermalingzhisp.)是靈芝生長到成熟期時從菌蓋彈射出來的細小孢子,是靈芝的生殖細胞,遺傳了靈芝的全部活性物質[4],破壁后的靈芝孢子粉具有顯著的藥理作用主要有抗腫瘤、免疫調節(jié)、調節(jié)血脂以及對神經、心血管和呼吸系統(tǒng)的調節(jié)改善作用[5-10]。

靈芝孢子粉的一個重要的產品是靈芝孢子油,是運用二氧化碳超臨界萃取法從靈芝孢子粉中提取得到的,靈芝孢子油提取后的殘渣中還有大量的多糖類活性成分,靈芝孢子粉多糖具有免疫調節(jié)、提高機體耐缺氧能力、鎮(zhèn)靜和抗炎等藥理作用的物質基礎[11],因此值得進行再利用的研究。馮翠萍等[12]介紹了靈芝孢子粉廢料的多糖提取,嚴煥雄等[11]研究了多糖提取因素的影響,均未對孢子粉廢料多糖提取工藝進行優(yōu)化實驗。本研究用破壁靈芝孢子粉脫油之后的廢料為原料,從液料比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間四個提取條件進行考察,并采用響應面法優(yōu)化其制備工藝。進行粗多糖提取工藝的研究,為靈芝孢子粉廢料的再利用價值建立基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

安徽靈芝孢子粉廢料浙江靈芝孢子粉廢料,福建靈芝孢子粉廢料。葡萄糖、濃硫酸國藥集團藥業(yè)股份有限公司;分析純苯酚重蒸餾后使用國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

FA2004N型分析天平上海精密科學儀器有限公司;SynergyHT酶標儀美國Bio-TEK公司;HetoPL3000冷凍干燥機Rouan公司;HWS28型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學儀器有限公司;電磁爐浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司;高速冷凍離心機Allegra 28R CentrifugeBECKMAN COULTER.INC。

1.2實驗方法

1.2.1靈芝孢子粉廢料粗多糖提取工藝流程孢子粉廢料100 g(精確到0.1 g)→蒸餾水2 L(液料比20∶1)→100 ℃提取2 h→離心→重復提取一次→上清合并并濃縮→離心→上清→凍干→計算粗多糖得率

粗多糖得率(%)=(粗多糖干重/原料重量)×100

1.2.2多糖含量的測定粗多糖含量測定:苯酚-硫酸法[13],以葡萄糖為標品。

稱取粗糖50 mg,加入2 mL蒸餾水溶解后,加入8 mL無水乙醇(80%醇沉),靜置30 min,離心,沉淀加入10 mL蒸餾水溶解,用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.2.1多糖標準液的配制精確稱取0.01 g葡萄糖標準品于105 ℃烘箱中烘至恒重,用蒸餾水定容至100 mL,搖勻制得0.1%葡萄糖標準液。

1.2.2.2標準曲線的繪制分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL上述葡萄糖標準液于試管中,補水至總體積1 mL,加入5%苯酚溶液1 mL,混勻后迅速加入5 mL濃硫酸,置沸水浴中加熱15 min,冰水冷卻至室溫,于490 nm處測吸光值,繪制標準曲線。

1.2.3單因素實驗在實際生產過程中,液料比越少,多糖溶解不完全,液料比越大,消耗的時間及能源越多,而且不利于后序的純化工作[4];多糖提取溫度過低,溶解不充分,溫度過高,會破壞多糖的結構,影響多糖的活性;提取時間過短,多糖溶解不充分,部分糖提取不出而影響得率,提取時間過長,可能引起多糖的水解,從而導致得率降低[14];提取次數(shù)過多,耗時耗能也越多,不利于濃縮和提純。綜合以上機理,單因素水平設計如下:

固定粗多糖提取溫度為100 ℃,提取次數(shù)1次,提取時間2 h,選取液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1,分析液料比對粗多糖得率的影響;固定液料比為20∶1,提取時間為2 h,提取次數(shù)為1次,選取提取溫度40、60、80、100 ℃,分析提取溫度對粗多糖得率的影響;固定液料比為20∶1,提取溫度為100 ℃,提取時間為2 h,選取提取次數(shù)為1、2、3次,分析提取次數(shù)對粗多糖得率的影響;固定液料比為20∶1,提取溫度為100 ℃,提取次數(shù)為1次,選取提取時間為1、2、3 h,分析提取時間對粗多糖得率得的影響。

1.2.4響應面設計基于單因素的實驗結果,選取影響較大的液料比、提取溫度、提取時間三個因素設計響應面實驗,運用Box-Behnken設計方案,以液料比、提取溫度、提取時間為自變量,分別以X1、X2、X3來表示,并以+1、0、-1分別對自變量的高、中、低三個水平,按方程Y=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼,其中Xi為自變量的真實值,X0為實驗中心點變量的真實值,ΔX為變量的變化步長,以靈芝粗多糖得率(Y)為響應值,實驗因素及水平如表1所示。

表1　響應面法分析實驗因素及水平編碼

2　結果與分析

2.1多糖含量測定標準曲線

按1.2.2.2項方法,以吸光值為縱坐標,葡萄糖濃度為橫坐標繪制葡萄糖標準曲線,如圖1,求得標準曲線回歸方程為y=4.8833x+0.0463,R2=0.9993。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　The standard curve of glucose

將安徽、浙江、福建種植基地的靈芝孢子粉廢料三個樣品材料按照1.2.1的方法進行處理,分別得粗多糖的得率為10.80%、9.29%、14.78%。將提取得到的粗糖經80%醇沉,利用苯酚-硫酸法測得多糖含量分別為14.16%、19.94%、13.93%。由此結果可以看出,經破壁脫油后的靈芝孢子粉廢料中還含有大量多糖,有再次提取利用的價值。三種樣品中,福建靈芝孢子粉廢料多糖得率最高,故選其為粗多糖提取工藝研究的樣品材料,做單因素實驗及響應面實驗。

2.2單因素實驗結果分析

根據(jù)1.2.3項實驗設計進行單因素實驗,取三次重復的平均值,結果如圖2所示。

圖2　單因素對粗多糖得率的影響Fig.2　Effect of single factors on crude polysaccharides yield

由圖2可以看出,液料比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間這四個單因素對粗多糖得率都有一定的影響,隨著單因素值的增大,粗多糖得率有不同程度的增大趨勢。液料比與粗多糖得率呈正相關,在液料比20∶1之后,隨著液料比的增大,粗多糖得率增大較緩慢;提取溫度從40 ℃增至80 ℃過程中,粗多糖得率增大較緩,80 ℃至100 ℃,隨著溫度提高,粗多糖得率增大幅度較大;提取次數(shù)越多,粗多糖得率越大,提取3次較提取2次粗多糖得率增大的不明顯,離心次數(shù)與離心程度對多糖的提取都具有一定的損失,考慮經濟因素和減少損失,提取次數(shù)2次為佳;隨著提取時間的增加,粗多糖得率增大,說明提取時間過短,粗多糖溶解不充分,提取不徹底。

2.3響應面法實驗設計

2.3.1響應面實驗設計及實驗結果利用Box-Behnken方法進行實驗設計,選取液料比、提取溫度、提取時間三個因素設計響應面實驗,提取次數(shù)為1次,其設計方案及結果如表2所示。

表2　響應面法設計方案及實驗結果

2.3.3建立與檢驗回歸方程用Design-Expert軟件二次多項回歸擬合表2中的粗多糖得率,獲得粗多糖得率對編碼自變量的多項回歸方程:

Y=10.04+1.17X1+0.97X2+0.60X3+0.59X1X2+0.48X1X3+0.41X2X3-0.37X12-0.54X22-0.50X32+0.31X12X2+0.17 X12X3

式中Y-多元回歸方程的響應值。

2.3.4響應面優(yōu)化分析料液比X1、提取溫度X2、提取時間X3及其交互作用對靈芝孢子粉廢料粗多糖得率(Y)的影響繪制出響應曲面,見圖3～圖5所示。

從圖3～圖5可以看出,提取溫度與液料比交互作用最明顯,液料比與提取時間交互作用較明顯,提取溫度與提取時間交互作用明顯。提取溫度、液料比對靈芝孢子粉廢料粗多糖得率的影響較大,隨著提取溫度、液料比的增加,粗多糖得率也隨之增加,提取時間對粗多糖得率也有較大的影響。

通過模型回歸分析,得到靈芝孢子粉廢料粗多糖提取的最佳條件為:液料比25.00∶1,提取溫度100.00 ℃,提取時間3.00 h。在此條件下粗多糖得率理論值為13.320%。

為了驗證優(yōu)化的條件,采用上述最佳提取條件做靈芝孢子粉廢料粗多糖的提取實驗,提取條件為:液料比25∶1,提取溫度100 ℃,提取時間3 h。在此條件下粗多糖得率為13.204%,與理論值的相對誤差小于1%。因此,采用此響應面法優(yōu)化得到的靈芝孢子粉廢料粗多糖的提取條件參數(shù)可靠,具有實用價值。

表3　回歸模型方差分析

圖3　液料比和提取溫度交互作用影響靈芝孢子粉廢料粗多糖得率的響應面圖Fig.3　Response surface of the effects of the ratio of solvent to material and temperature on crude polysaccharides yield

圖4　液料比和提取時間交互作用影響靈芝孢子粉廢料粗多糖得率的響應面圖Fig.4　Response surface of the effects of the ratio of solvent to material and extraction time on crude polysaccharides yield

圖5　提取溫度和提取時間交互作用影響靈芝孢子粉廢料粗多糖得率的響應面圖Fig.5　Response surface of the effects of temperature and extraction time on crude polysaccharides yield

3　結論

本研究利用水提法對三個不同品種的靈芝孢子粉廢料進行粗多糖提取,由測得的粗多糖得率得反映出靈芝孢子粉廢料具有再利用價值,且不同品種的靈芝孢子粉殘渣含有的粗多糖含量不同,其中浙江靈芝生產基地的孢子粉品種多糖含量最高,福建靈芝生產基地的孢子粉廢料粗多糖得率最高。

選取福建靈芝孢子粉廢料這一品種對其粗多糖的提取工藝做響應面實驗的研究,通過實驗結果的分析,液料比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間四個因素均對粗多糖提取有不同程度的影響,響應面選取液料比、提取溫度、提取時間三個影響因素,并得到理論最佳提取條件為:液料比25.00∶1,提取溫度100.00 ℃,提取時間3.00 h,此條件下粗多糖得率的理論值為13.320%。實際提取條件亦為液料比25∶1,提取溫度100 ℃,提取時間3 h,實測值為13.204%,理論值與實測值誤差小。因此,響應面法優(yōu)化靈芝孢子粉廢料粗多糖的提取條件是可行的。

[1]戴玉成,曹云,周麗偉,等.中國靈芝學名之管見[J].菌物學報,2013,32(6):947-952.

[2]Cao Y,Wu SH,Dai YC. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom“Lingzhi”[J]. Fungal Diversity,

2012,56:49-62.

[3]干偉偉,常繼東.靈芝多糖提取條件的響應曲面法優(yōu)化研究[J].江蘇農業(yè)科學,2009,1:259-262.

[4]孟凡冰,李云成,張淑蓉，等.靈芝孢子多糖提取工藝優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(1):209-212.

[5]杜冰,溫升南,唐健,等.超高壓提取靈芝孢子粉多糖的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(4):420-422.

[6]唐柳,張志軍,魏雪生,等.靈芝孢子粉藥理作用研究進展[J].天津農業(yè)科學,2011,17(3):25-28.

[7]劉虹,周甄鴻,劉志宏.靈芝孢子粉藥理作用研究進展[J].天津中醫(yī)學院學報,2002,21(4):50-51.

[8]Sliva D,Labarrere C,Slivova S,et al. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate canceer cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,298:603-612.

[9]Liu RM,Zhong JJ. Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J]. Process Biochemistry,2011,18(5):349-355.

[10]Wang JH,Zhou YJ,Zhang M,et al. Active lipids of Ganoderma lucidum spores-induced apoptosis in human leukemia THP-1 cells via MAPK and PI3K pathways[J]. Journal of Ethnopharmacology,2012,139(2):582-589.

[11]嚴煥雄,羅愛勤,施家輝.靈芝孢子粉中多糖的制備工藝研究[J].中國執(zhí)業(yè)藥師,2014,11(1):16-19.

[12]馮翠萍,王曉聞,程旭東,等.靈芝孢子粉多糖的提取及其生物活性研究[J].中國食品學報,2009,9(3):58-62.

[13]黎晶晶,徐格非.苯酚-硫酸法測定靈芝多糖含量的研究[J].杭州化工,2008,38(1):23-26.

[14]黃璞,謝明勇,聶少平,等.響應面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J].食品科學,2007,28(10):200-203.

[15]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].第二版.杭州:浙江大學出版社,1999.

Study on the extraction technology of crude polysaccharides from defattedganodermalingzhispore scarp

JIA Hong-yan1,2,WANG Chen-guang3,ZHANG Zhong2,ZHOU Jin3,ZHOU Shuai2,ZHANG Jin-song2,TANG Qing-jiu2，*

(1.College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.National Engineering Research Center of Edible Fungi,Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization(South),Ministry of Agriculture,P. R.,China,Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 201403,China;3.Shanghai Baixin Bio-Tech CO.,Ltd,Shanghai 201403,China)

To explore the recycling value of defattedGanodermalingzhispore scarp,the extraction technology of crude polysaccharides from defattedGanodermalingzhispore scarp was optimized. On the base of the single factor investigations,the ratio of water to material,the extraction temperature and extraction duration were studied with the Box-Behnken experimental design,and their interactions on the yield of crude polysaccharides from defattedGanodermalingzhispore scarp can be concluded as follows:interactions of time and temperature,temperature and ratio of solvent to material were remarkable,but the interaction of ratio of solvent to material and time was unremarkable. The optimum conditions were the ratio of solvent to material of 25.00∶1,temperature of 100.00 ℃ and time duration of 3.00 h. On these conditions,the yield of crude polysaccharides was up to 13.320%. The actual conditions were the ratio of 25∶1,temperature of 100 ℃ and time duration of 3 h,and the actual extraction yield was 13.204%. Error between theoretical yield and actual yield was less than 1%. It was maximal extraction yield of crude polysaccharides from defattedGanodermalingzhispoer scarp with optimized process parameters.

defattedGanodermalingzhispore scarp;crude polysaccharides;response surface methodology;extraction process

2015-11-02

賈紅巖(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：藥用真菌學，E-mail：jhyan0309@163.com。

唐慶九(1969-)，女，博士，研究員，研究方向：真菌化學和藥理學，E-mail：tangqingjiu@saas.sh.cn。

國家科技支撐計劃課題(2013BAD16B08-02)。

TS209

B

1002-0306(2016)11-0217-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.036