纈沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞活性損傷的干預(yù)作用

蔡承敏何玉茂余亞?wèn)|

(九江市中醫(yī)醫(yī)院, 江西 九江 332000)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。 它已經(jīng)成為終末期腎病發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[1]。 但是,糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理尚未完全確定,并且尚無(wú)用于預(yù)防和治療糖尿病腎病發(fā)生的藥物,這已成為世界范圍內(nèi)公共衛(wèi)生的負(fù)擔(dān)。 最近,腎小球系膜細(xì)胞功能障礙已被證明在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[2]。 纈沙坦(valsartan, Val)是血管緊張素II 受體拮抗劑抗高血壓類(lèi)藥物,對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用[3],通過(guò)上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)糖尿病腎病的功能[4]。在糖尿病小鼠腎小球組織中,纈沙坦影響NOTCH1信號(hào)通路表達(dá)[5]。 盡管纈沙坦的臨床使用有所增加,但其對(duì)糖尿病腎病治療作用的潛在機(jī)制仍不清楚,需要進(jìn)一步研究。 作為高度保守的信號(hào)調(diào)節(jié)劑,NOTCH 信號(hào)通路在諸如細(xì)胞增殖,分化,凋亡和成熟等生理過(guò)程中起著重要作用[6]。NOTCH1 蛋白是NOTCH1 蛋白家族中具有代表性的受體,其下游細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是治療各種腎疾病的關(guān)鍵靶標(biāo)[7]。 根據(jù)上述研究結(jié)果,推測(cè)纈沙坦對(duì)糖尿病腎病治療作用與NOTCH1 信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。 因此,當(dāng)前的研究建立了高葡萄糖(HG)誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 損傷模型,模擬糖尿病腎病來(lái)對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡進(jìn)行評(píng)估,采用不同濃度纈沙坦干預(yù)細(xì)胞,并結(jié)合NOTCH1 信號(hào)通路,以確定纈沙坦對(duì)糖尿病腎病治療作用的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC)。

1.2 主要試劑

纈沙坦購(gòu)自北京諾華制藥公司,Dulbecco's modified eagle medium(DMEM 培養(yǎng)基)購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；NOTCH1 信號(hào)通路激活劑Jagged 1/Fc融合蛋白購(gòu)自于美國(guó)R＆D System 公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購(gòu)自上海君瑞生物公司；噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質(zhì)分析試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；兔抗細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體、兔抗活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗體、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體、兔抗jagged1 抗體、兔抗NOTCH1 抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自上海艾博抗公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng),并置于飽和濕潤(rùn)、37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組與處理

將HBZY-1 分為NC 組(即對(duì)照組,未處理的細(xì)胞),HG 組(即模型組,30 mmol/L 葡萄糖處理細(xì)胞48 h),Val 1 μmol/L 組(1 μmol/L 纈沙坦處理細(xì)胞48 h),HG+Val 0.01 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和0.01 μmol/L 纈沙坦處理細(xì)胞48 h[8]),HG+Val 0.1 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和0.1 μmol/L 纈沙坦處理細(xì)胞48 h),HG+Val 1 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和1 μmol/L 纈沙坦處理細(xì)胞48 h),HG+Val+PBS 組(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L纈沙坦和與激活劑等量的PBS 處理細(xì)胞48 h),HG+Val+ Jagged 1/Fc 組(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L 纈沙坦和終濃度為2 μg/mL NOTCH1 信號(hào)通路激活劑Jagged 1/Fc 融合蛋白處理細(xì)胞48 h[9])。 其中,纈沙坦使用培養(yǎng)基配制出0.01、0.1、1 μmol/L 的濃度。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1 和NOTCH1 的表達(dá)

收集不同處理的HBZY-1,在RIPA 緩沖液中進(jìn)行蛋白的抽提。 使用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒對(duì)蛋白定量。 然后取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。蛋白分離后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,然后用5%脫脂奶粉封閉膜2 h。 隨后將膜與Ⅰ抗在4℃孵育過(guò)夜,并與HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗(1 ∶5000)室溫孵育2 h。 Ⅰ抗包括抗CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1、NOTCH1(均為1 ∶1000 稀釋)和抗β 肌動(dòng)蛋白(β-actin)(1 ∶2000 稀釋)。 通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影、曝光。 以β-actin 為對(duì)照,采用凝膠成像分析各蛋白的表達(dá)水平。

1.3.4 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

各組HBZY-1 經(jīng)不同的處理后,分別在96 孔板中接種24 h、48 h 和72 h。 接下來(lái),每孔細(xì)胞中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液,并繼續(xù)孵育。 4 h 后,加入200 μL 的二甲基亞砜充分溶解反應(yīng)結(jié)晶。 在Bio Tek 酶標(biāo)儀讀取450 nm 的吸光度,以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組吸光度的比值表示細(xì)胞的增殖活力。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡

各組HBZY-1 經(jīng)不同的處理后,根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒的指示,收集1×105個(gè)細(xì)胞,經(jīng)70%冷乙醇固定后,加入500 μL PI/RNase A 染色工作液,避光孵育30 ～60 min,于流式細(xì)胞儀檢測(cè)波長(zhǎng)488 nm 處的紅色熒光,分析細(xì)胞周期。 遵循Annexin VFITC/PI 試劑盒的規(guī)程,HBZY-1 使用binding buffer重懸,收集1×105個(gè)細(xì)胞,加入5 μL Annexin VFITC 混勻和5 μL PI 工作液混勻,之后遮光反應(yīng)15 min,通過(guò)FACSCalibur 流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,計(jì)量資料表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()。 兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 纈沙坦促進(jìn)高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 增殖

MTT 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。 與NC 組相比較,Val 1 μmol/L 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 24 h、48 h和72 h 的增殖活力無(wú)顯著變化(P＞0.05),而HG 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的增殖活力明顯降低(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的細(xì)胞增殖活力顯著升高,且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。

2.2 纈沙坦促進(jìn)高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 細(xì)胞周期

Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1中CyclinD1 蛋白表達(dá)顯著降低,G0-G1 期細(xì)胞比例明顯增加,S 期細(xì)胞比例顯著減少(P＜0.05),G2-M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L組和HG+Val 1 μmol/L 組HBZY-1 的CyclinD1 蛋白表達(dá)和S 期細(xì)胞比例顯著升高,G0-G1 期細(xì)胞比例明顯降低,且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05),同時(shí),G2-M期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

圖1 纈沙坦促進(jìn)高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 增殖Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 1 Valsartan promoted the proliferation of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 after high glucose treatment

圖2 纈沙坦促進(jìn)高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1(48 h)細(xì)胞周期和CyclinD1 蛋白的表達(dá)Note.A, Flow cytometry to detect the cell cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1.B, Western blot to detect the expression of CyclinD1 protein.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 2 Valsartan promoted the cell cycle and CyclinD1 protein expression in rat glomerular mesangial cells HBZY-1 (48 h) treated with high glucose

2.3 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 凋亡

Western blot 檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平明顯增加,Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著減少,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高,細(xì)胞凋亡率顯著減少,均呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。

2.4 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 NOTCH1 信號(hào)通路

Western blot 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 中jagged1和NOTCH1 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組jagged1 和NOTCH1 蛋白表達(dá)水平明顯降低,且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。

圖3 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 凋亡Note.A, Western blot detection of valsartan inhibits the expression of HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in rat glomerular mesangial cells treated with high glucose for 48 h.B, flow cytometry detection of rat kidney HBZY-1 apoptosis of mesangial cells.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 3 Valsartan inhibited the apoptosis of HBZY-1 glomerular mesangial cells in rats treated with high glucose

2.5 NOTCH1 信號(hào)通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)纈沙坦對(duì)高糖處理的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 的增殖和細(xì)胞周期的影響

Western blot 檢測(cè)、MTT 檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。 與HG+Val+PBS 組相比較,HG+Val+Jagged 1/Fc 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 的NOTCH1、jagged1 蛋白表達(dá)水平明顯升高,CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低,且24 h、48 h 和72 h 的細(xì)胞增殖活力明顯降低,G0-G1 期細(xì)胞比例顯著增加,S 期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05),G2-M 期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

2.6 NOTCH1 信號(hào)通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)纈沙坦對(duì)高糖處理的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 凋亡的影響

Western blot 檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。 與HG+Val+PBS 組 相 比 較,HG+Val+Jagged 1/Fc 組大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低, 且細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

圖4 Western blot 檢測(cè)大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 jagged1 和NOTCH1 蛋白的表達(dá)Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 4 Western blot detected the expression of HBZY-1 jagged1 and NOTCH1 proteins in rat glomerular mesangial cells

臨床上,糖尿病腎病具有多種癥狀特征,例如蛋白尿。 作為腎小球的固有細(xì)胞之一,腎小球系膜細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要的作用[9]。 越來(lái)越多的證據(jù)已經(jīng)確認(rèn),腎小球系膜細(xì)胞凋亡有助于蛋白尿的加重和糖尿病性腎小球硬化的發(fā)展[10]。 因此,確定導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制對(duì)于深入了解糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理是十分必要的。 本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大鼠腎小球系膜細(xì)胞暴露于高糖條件下可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少,阻滯細(xì)胞周期,且細(xì)胞凋亡增加[11]。 而纈沙坦的處理可以減輕高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞損傷,并且,可以抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中NOTCH1 信號(hào)通路活性,證明了纈沙坦在預(yù)防或治療糖尿病腎病方面的潛力。

纈沙坦是臨床常用的降血壓藥物,此外,其在糖尿病腎病中的功能得到了廣泛關(guān)注。 各種研究已經(jīng)證明,纈沙坦可以保護(hù)高糖刺激的腎小球足細(xì)胞或系膜細(xì)胞損傷,產(chǎn)生治療糖尿病腎病的功效[12-13]。 目前的研究評(píng)估了纈沙坦在高糖損傷大鼠腎小球系膜細(xì)胞中的作用。 與HG 模型組相比,0.01、0.1、1 μmol/L 纈沙坦干預(yù)細(xì)胞48 h 后,細(xì)胞的增殖活力、S 期細(xì)胞比例、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),G0-G1 期細(xì)胞比例、細(xì)胞的凋亡率、促凋亡蛋白Bax、凋亡執(zhí)行蛋白酶Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著提高。 當(dāng)前研究的結(jié)果表明,纈沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 損傷表現(xiàn)出治療作用。 值得注意的是,纈沙坦的濃度越高,其治療效果越顯著。

圖5 NOTCH1 信號(hào)通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)纈沙坦對(duì)高糖處理的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 的增殖和周期的影響Note.A,MTT detection of cell proliferation activity.B,Western blot detection of rat mesangial HBZY-1 jagged1,NOTCH1,CyclinD1 protein expression.C, Flow cytometry detection of rat mesangial cells HBZY-1 cell cycle.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 5 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the proliferation and cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

圖6 NOTCH1 信號(hào)通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)纈沙坦對(duì)高糖處理的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 凋亡的影響Note.A, Flow cytometry to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 apoptosis.B, Western blot to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 6 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the apoptosis of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

NOTCH 信號(hào)通路在維持進(jìn)化過(guò)程中起著高度保守的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用,并在細(xì)胞的正常增殖和分化中發(fā)揮重要作用。 在脊椎動(dòng)物中,配體(Delta-like 或Jagged 蛋白)激活跨膜受體NOTCH1-4。 激活后,NOTCH 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的切割允許其易位至細(xì)胞核,從而通過(guò)途徑核效應(yīng)子RBPJ激活目標(biāo)基因,例如HES bHLH 轉(zhuǎn)錄因子[14]。 該通路的失調(diào)與多種疾病有關(guān),包括糖尿病腎病。 越來(lái)越多的研究檢測(cè)到,糖尿病腎病中NOTCH1 信號(hào)傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活[15]。 在糖尿病腎病的病理過(guò)程中,高血糖和血液動(dòng)力學(xué)改變會(huì)誘導(dǎo)NOTCH信號(hào)通路的jagged1 配體和NOTCH1 受體表達(dá)增加,從而導(dǎo)致受體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[16]。 一些研究已證明,阻斷NOTCH1 信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)糖尿病腎病是一種有效的治療策略[17]。 本研究表明,不同濃度的纈沙坦均可抑制高糖誘導(dǎo)的NOTCH1 信號(hào)通路活性,降低jagged1、NOTCH1 蛋白表達(dá),并呈濃度依賴(lài)性,與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的纈沙坦降低糖尿病小鼠腎小球組織中jagged1、Notch1 表達(dá)的結(jié)果相同。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),NOTCH1 信號(hào)通路激活劑Jagged 1/Fc 融合蛋白處理細(xì)胞后,纈沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1 增殖、周期的促進(jìn)作用被部分逆轉(zhuǎn),其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用也被部分逆轉(zhuǎn)。 由此可見(jiàn),纈沙坦可以保護(hù)大鼠腎小球系膜細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的損傷,其潛在機(jī)制是通過(guò)抑制NOTCH1 傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,0.01、0.1、1 μmol/L 濃度的纈沙坦可以濃度依賴(lài)性的促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖和周期,并抑制期凋亡,其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制與抑制NOTCH1 信號(hào)通路活性有關(guān),這為糖尿病腎病治療藥物的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑和依據(jù)。