CRISPR/Cas系統(tǒng)在抗菌治療領域的研究進展

曾珍，胡瑩

·綜述·

CRISPR/Cas系統(tǒng)在抗菌治療領域的研究進展

曾珍，胡瑩

650101 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科

抗生素能夠有效控制細菌感染，但隨著抗生素的濫用與細菌適應，細菌耐藥性問題日益嚴重，已對全球公共衛(wèi)生與環(huán)境安全構成重大威脅[1]。削弱細菌的耐藥性，防止出現多重耐藥以及耐藥性傳播已經成為急需解決的問題。此外，傳統(tǒng)的抗生素一般都是廣譜類抗生素，在對致病菌進行滅殺時也會對其他有益菌造成一定的損害，長期使用可能會導致菌群失調并加劇細菌耐藥[2]。

細菌在面對外源遺傳物質（如噬菌體和質粒）的入侵時，會形成一個抵御這些外源遺傳物質的免疫防御系統(tǒng)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及關聯基因（CRISPR associated，Cas）組成的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)[3-4]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)于 1987 年由 Ishino 等[5]在大腸埃希菌中首次發(fā)現。之后的研究表明，CRISPR/Cas 系統(tǒng)還分布于 40% 已測序細菌和 90% 已測序古細菌的基因組中[6-7]。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經被開發(fā)成為一種新型的抗菌劑，它能通過靶向破壞目標基因（如抗生素耐藥基因或毒力基因），使細菌恢復對抗生素的敏感甚至直接致其死亡，同時限制有害基因在微生物間的轉移和流行。此外，有研究已經證實，利用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以從混合菌群中選擇性地殺傷某種特定細菌，而不會對周圍其他菌株產生影響，從而為“微生物組編輯”的探索應用開辟了一種新的思路和方法。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結構及作用機制

近年來，CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)展迅猛，除了基因編輯領域，在生物醫(yī)學及藥物開發(fā)等不同領域中也逐步得到應用[8]。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據 Cas 蛋白作用機制的不同，被劃分為 Type I、Type II 和 Type III 等 3 種不同的類型[9]，并且還可以進一步細分。其中，Type II 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)（CRISPR/Cas9 系統(tǒng)）具有結構簡單、操作方便、特異性高等特點，是研究最為深入且應用最成熟的一種類別。Type II 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的位點結構如圖 1 所示，主要由 CRISPR 序列、上游的前導序列（Leader）和 Cas 基因三部分構成。其中，CRISPR 序列由多個短而高度保守的重復序列（21 ~ 48 bp）和多個長度相似的間隔序列（26 ~72 bp）組成。在重復序列中含有長度為 5 ~ 7 bp 的回文序列，可以形成發(fā)卡結構，它是識別靶標基因的關鍵元件。間隔序列則是被細菌俘獲的外源 DNA 序列。CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)揮作用的關鍵之一就是能夠對再次入侵細菌的這些外源遺傳物質予以精確打擊。前導序列位于 CRISPR 位點的上游，長約 550 bp，它被認為是 CRISPR 序列的啟動子。上游的 Cas 基因是一個多態(tài)性的家族基因，包括有 Cas 1 ~ 10 等多種類型，它是 CRISPR 免疫防御途徑中的基本組成成分。此外，Cas 基因編碼的 Cas 蛋白都可以和 CRISPR 序列區(qū)域共同發(fā)生作用。Cas 基因與 CRISPR 序列共同進化，最終在細菌中形成了高度保守的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)[10]。

圖 1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的位點結構圖

在 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，CRISPR 序列通過與 Cas 蛋白進行配合來防御外源遺傳物質的入侵，其作用機制可以分為三步。①外源 DNA 的俘獲。當病毒入侵時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)需要俘獲一段外源 DNA 序列，然后找到其原間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并將鄰近 PAM 的 DNA 序列作為候選的原間隔序列。接著，在 Cas1/2 蛋白復合物以及其他酶的協(xié)助下，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會從這段外源 DNA 序列中將原間隔序列剪切下來，插入到基因組 CRISPR 位點的 5' 端，從而將其作為新的間隔序列整合到基因組的 CRISPR 序列之中。②crRNA（CRISPR RNAs）的合成。在前導區(qū)的調控下，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會在病毒入侵時轉錄出前體 crRNA（pre-CRISPR-derived RNA，pre-crRNA）和反式激活 crRNA（trans-acting crRNA，tracrRNA）兩種類型的 RNA。tracrRNA 的主要功能是作為連接 crRNA 和 Cas 蛋白的橋梁。接著，根據入侵者的類型同時在核糖核酸酶 III 的協(xié)助下，pre-crRNA、tracrRNA 以及 Cas9 編碼的 Cas 蛋白組成的復合體會選取對應的間隔序列 RNA 并對其進行剪切，crRNA 因此得以形成。為了下一步的剪切，crRNA、Cas9 蛋白以及 tracrRNA 會進一步組合，形成最終的復合物。③靶向干擾。在病毒的二次感染中，為了能識別出與 crRNA 互補的原間隔序列，crRNA、Cas9 以及 tracrRNA 組成的復合物會對整個外源DNA 序列進行掃描，同時定位到 PAM/原間隔序列的區(qū)域。此時，外源 DNA 的雙鏈將被解開，互補鏈會與合成的 crRNA 進行雜交，同時另一條鏈保持游離狀態(tài)。隨后，Cas9 蛋白發(fā)揮作用，與 crRNA 互補的 DNA 鏈以及非互補的 DNA 鏈被剪切。最終，Cas9 使 DNA 雙鏈斷裂，沉默外源 DNA 的表達，入侵者也因此被消滅。

作為一種強大的基因編輯技術，CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以定點且精確地對目標基因進行編輯。隨著對 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的進一步研究，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經被廣泛應用于基因敲除、基因替換、基因激活、疾病模型構建，甚至是基因治療等領域。

2 CRISPR/Cas 在抗菌治療中的應用

2.1 CRISPR/Cas 的抗耐藥菌應用

隨著抗生素的濫用以及細菌適應，細菌多重耐藥以及耐藥性傳播等問題不斷出現，采取必要的措施削弱細菌的耐藥性已刻不容緩[11]。針對這一現象，一些新型的非抗生素療法在針對耐藥菌感染方面的優(yōu)異表現開始得到研究人員的關注。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以通過設計靶向耐藥相關基因或耐藥細菌的基因組 gRNA（guide RNA），然后對耐藥細菌特有靶向序列進行切割，使耐藥細菌對抗生素的敏感得以恢復甚至直接致其死亡，在基因水平上為防治細菌多重耐藥的研究提供了新的方向[12]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)抗耐藥菌的基本原理是利用噬菌體將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)相關基因傳遞到耐藥菌內，當靶向耐藥基因位于耐藥性質粒上時，CRISPR/Cas系統(tǒng)對靶向耐藥基因的切割會導致耐藥性質粒的丟失，耐藥菌對抗生素的敏感性能夠被恢復。當靶向耐藥基因位于耐藥細菌的基因組上時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)切割靶向耐藥基因會導致 DNA 雙鏈斷裂，從而使得耐藥菌死亡[13]。此外，如果 CRISPR/Cas 系統(tǒng)能夠在耐藥菌中穩(wěn)定存在并且遺傳下來，當含有相同靶向耐藥基因的 DNA 片段再次入侵耐藥菌時，CRISPR/Cas 系統(tǒng)能夠對其進行防御，并且可以抑制耐藥基因的傳播[14]。

通過 CRISPR/Cas 系統(tǒng)沉默耐藥細菌的耐藥相關基因，可以達到抑制細菌耐藥性的目的。Kim 等[15]為了恢復產超廣譜 β-內酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）大腸桿菌對抗生素的敏感性，利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向超廣譜耐 β-內酰胺類抗生素的大腸桿菌中的抗生素抗性基因，成功清除了產 ESBL 大腸桿菌內的抗生素耐藥性質粒。因此，這種對耐藥性抗生素的重新敏化（ReSAFR）技術可對攜帶抗生素耐藥性質粒的多藥耐藥性（MDR）細菌進行治療。Citorik 等[16]和 Bikard 等[17]分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體內本身所含的抗生素耐藥性質粒為靶標，同時利用噬菌粒為載體來傳遞 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。最終，細菌中的抗生素耐藥性質粒被成功清除，耐藥菌對抗生素的敏感性也得到恢復。Chen 和 Novick[18]利用噬菌粒介導的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)有效去除了金黃色葡萄球菌中攜帶抗生素抗性基因的耐藥性質粒，從而使金黃色葡萄球菌對抗生素重新敏感化。

細菌針對抗生素不斷出現的耐藥性給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，對 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的研究為人們解決這一問題迎來了轉機[19]。此外，CRISPR 系統(tǒng)的結構和功能與細菌的耐藥性密切相關，對兩者之間的關系進行深入分析將有助于更好地理解細菌的耐藥機制，進而為防治細菌耐藥提供新的方向。

2.2 CRISPR/Cas選擇性靶向細菌群體

通過對細菌生長過程中一些保守的代謝途徑進行抑制或破壞，廣譜類抗生素往往能達到不錯的殺菌或抑菌效果，但廣譜類抗生素在殺菌過程中無法有效區(qū)分殺菌對象，除了滅殺致病菌也會損害有益菌。長期使用廣譜類抗生素也會產生一些問題，如導致環(huán)境與人體腸道內的菌群失調、細菌耐藥性的不斷累積與傳播等。因此，為了維持正常的微生物菌群，能夠在特異性地殺傷某種病原菌時不會對環(huán)境中的其他微生物造成不利影響顯得尤為重要。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的出現，使得人們可以設計具有特定殺菌作用的CRISPR 抗菌劑。

2014 年，Gomaa 等[20]的研究表明，使用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)進行基因組靶向可用于個別細菌菌株和物種的序列特異性和可滴定去除。此外，還以大腸桿菌中的 I-E 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為模型，證明了 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的自我靶向作用，同時成功清除了混合菌株中某一特定的菌株并且使所有其他鄰近的菌株不受影響。為了對細菌殺傷的特異性進行控制，該研究采用了靶向某個細菌獨有序列的方式，從而為人們實現選擇性地殺傷混合菌群中某種特定細菌奠定了堅實的理論和實驗基礎。Bikard 等[17]利用含有CRISPR/Cas 系統(tǒng)的噬菌體侵染金黃色釀膿葡萄球菌后，通過靶向毒力基因，成功殺死了有毒的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。此外，在小鼠皮膚感染的實驗中，CRISPR/Cas 抗菌素也能夠有效減少小鼠皮膚定植模型中的金黃色葡萄球菌的數量。Citorik 等[16]以噬菌體作為運送載體，將完整的外源性 CRISPR/Cas 系統(tǒng)傳遞到大腸桿菌之中，通過靶向 β-內酰胺酶 1（NDM-1）基因和含一個突變的 gyrA 基因，選擇性殺死了表達特定靶基因的耐喹諾酮大腸桿菌。

此外，有研究報道可以應用 CRISPR/Cas 技術來研發(fā)序列特異性的抗生素，這些抗生素發(fā)揮作用的關鍵是使用單鏈向導RNA(single-guide RNA，sgRNA)引導 Cas9 核酸內切酶選擇性靶向病原體特定的 DNA 序列[16-17]。與常規(guī)的抗生素相比，在選擇好特定的靶基因后，CRISPR/Cas 抗菌劑可以用于與靶基因相匹配的 sgRNA 進行編程。因此，在選擇性地殺死含有特定靶基因的細菌時，CRISPR/Cas 抗菌劑能夠使周圍其他的細菌不受影響。因此，CRISPR/Cas 系統(tǒng)為研究者們創(chuàng)造了以序列特異性方式操縱復雜細菌種群的機會。

3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的問題及應對措施

由于具有對病原菌序列高效且特異性清除的優(yōu)點，CRISPR/Cas 抗菌藥具有不錯的效果和特異性，能夠成為一種有潛力替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌武器。但是，將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)應用于抗菌治療仍然存在一些問題有待解決。

首先，使用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為殺菌藥物，需要找到一種安全有效的遞送途徑將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)運輸到細菌細胞內。噬菌體天然靶向細菌的優(yōu)勢能夠有效地將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)相關基因運輸到細菌中。但是，利用噬菌體作為 CRISPR/Cas 系統(tǒng)運載工具也存在和噬菌體療法相同的缺點，如噬菌體侵染的專一性會導致其應用范圍過窄[21]，細菌在面對噬菌體入侵時產生的細胞免疫反應會導致噬菌體入侵的效率降低，噬菌體裂解病原菌造成的內毒素釋放，以及噬菌體在應用到臨床上時需要考慮的安全性問題。針對上述問題，可以采取一些方法解決，一種方法是改造噬菌體讓其能夠適應更多的宿主[22]，另一種方法是使用雞尾酒療法，即將多種噬菌體混合在一起然后對菌群進行侵染[23]。此外，還有研究者提出了將細胞外囊泡作為 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的運載工具[24]、采用質粒接合的方式運輸 CRISPR/Cas 系統(tǒng)等不同方法，不過這些方法在有效性和安全性方面尚有不足，效率也比較低?？傊?，現有的各種 CRISPR/Cas 系統(tǒng)遞送方法仍有較多的局限和不足，需要不斷進行改進和優(yōu)化，同時還應繼續(xù)研究新的遞送方法。

其次，CRISPR/Cas 系統(tǒng)存在一定的脫靶效應[25]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的特異性取決于 sgRNA 上的識別序列，脫靶效應就是CRISPR/Cas 系統(tǒng)設計的某個位點的 sgRNA可能會識別其他位點，從而造成在切開靶點位置的同時存在切開其他位點的可能性。為了盡可能避免脫靶效應，需要將 CRISPR 相關蛋白 Cas9 引導至其基因組中精確靶標的 sgRNA。當 Cas9 與靶基因的序列完美匹配時，Cas9 的靶向活性和正常功能才能得到保證。有很多工作致力于研究如何檢測 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的脫靶情況，GUIDE-Seq 高通量測序技術是一種通過高通量實驗手段在全基因組范圍鑒定 CRISPR/Cas 系統(tǒng)脫靶效應的方法，能夠很好地確定脫靶突變的位置以及突變頻率。此外，為了使 CRISPR/Cas 系統(tǒng)有針對性地避開可能脫靶的位點，降低甚至消除 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的脫靶效應，有研究者也開發(fā)了一些輔助軟件幫助 CRISPR/Cas 系統(tǒng)對特定基因序列的靶點進行篩選[26]。

因此，雖然 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯領域中已經取得了不錯的成果，但仍然還有很多地方需要進一步改進和完善，如對現有的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)遞送方法進行優(yōu)化，合理設計 sgRNA 以最大程度地提高靶標活性并最小化脫靶效應。這些問題如果能夠得到解決，CRISPR/Cas 系統(tǒng)勢必會迎來更大的發(fā)展。

4 總結與展望

利用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以開發(fā)序列特異性抗生素，選擇性地靶向細菌的抗生素耐藥基因，從而成為一種十分有潛力替代傳統(tǒng)抗生素的新型抗菌武器[27]。此外，CRISPR/Cas 系統(tǒng)還能夠專一地靶向致病細菌，并且使周圍其他的非病原性細菌群體不受CRISPR/Cas 系統(tǒng)的影響。

人類在與病原菌的斗爭過程中，因為抗生素的發(fā)現和使用而取得了階段性的勝利，但這種斗爭還將持續(xù)下去。目前，傳統(tǒng)抗生素的研發(fā)愈加困難，耐藥菌在不斷出現與傳播，除了對現有抗生素進行規(guī)范化管理和合理使用外，研發(fā)新型的抗菌藥物也迫在眉睫。作為在抗菌治療領域中嘗試的新型療法之一，雖然 CRISPR/Cas 系統(tǒng)依舊面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，但是仍然為我們研究開發(fā)新型抗菌藥物提供新的視角和啟示。未來，CRISPR/Cas 系統(tǒng)會在人類健康和醫(yī)學發(fā)展方面帶給我們更多驚喜。

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昆明醫(yī)科大學碩士研究生創(chuàng)新基金（2020S197）；云南省基礎研究計劃[2019FE001(-229)]

胡瑩，Email：hy2002@126.com

2020-08-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.011