人外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集、分離和保存

·中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)·

人外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集、分離和保存

目 次

前言……………………………………………………………………………………………………………… 87

1 范圍…………………………………………………………………………………………………………… 88

2 規(guī)范性引用文件……………………………………………………………………………………………… 88

3 術(shù)語和定義…………………………………………………………………………………………………… 88

4 總則…………………………………………………………………………………………………………… 89

5 實(shí)驗(yàn)原理……………………………………………………………………………………………………… 89

6 實(shí)驗(yàn)方法……………………………………………………………………………………………………… 89

7 質(zhì)量控制……………………………………………………………………………………………………… 92

參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………………………………………… 93

前 言

本文件按 GB/T 1.1-2020 給出的規(guī)則起草。

本文件由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會歸口。

本文件起草單位：中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會、生物芯片上海國家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（廣東省中醫(yī)院）。

本文件主要起草人：郜恒駿、沈曉瑩、杜莉利、亓垚、張小燕、許靖曼、陳明敏、陳曲波、葉揚(yáng)、李迪。

人外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集、分離和保存

1 范圍

本文件規(guī)定了采集、分離和保存人外周血單個(gè)核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)方法和質(zhì)量控制。

本文件適用于科研用人外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集、分離和保存，若用于臨床，應(yīng)按照臨床相關(guān)要求進(jìn)行操作。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 38576-2020 人類血液樣本采集與處理

3 術(shù)語和定義

以下術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

外周血單個(gè)核細(xì)胞 peripheral blood mononuclear cell, PBMC

外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞（造血干細(xì)胞等）。

3.2

淋巴細(xì)胞分離液 lymphocyte separation medium

一種密度介于1.075 ~ 1.090 g/ml 之間而近似于等滲的溶液，用它做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

3.3

RPMI-1640 培養(yǎng)基 RPMI-1640 medium

洛斯維?帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）研發(fā)的一類細(xì)胞培養(yǎng)基，1640 是培養(yǎng)基代號。

3.4

二甲基亞砜 dimethyl sulfoxide, DMSO

非質(zhì)子極性溶劑，常用于化學(xué)反應(yīng)、PCR 反應(yīng)以及在細(xì)胞、組織和器官的保存中用作玻璃化低溫冷凍防護(hù)劑。DMSO 用于細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基內(nèi)，可以保護(hù)細(xì)胞免受冰晶引起的機(jī)械性損傷。它也可以用于主培養(yǎng)、亞培養(yǎng)、重組異倍體、雜交瘤等系列細(xì)胞株，胚胎干細(xì)胞（ESC）和造血干細(xì)胞的冷凍保藏。另外常常與BSA 或FBS 混合使用。

3.5

臺盼藍(lán) trypan blue

也稱臺盼蘭、錐蟲藍(lán)、曲利苯藍(lán)，細(xì)胞活性染料，常用于檢測細(xì)胞膜的完整性，檢測細(xì)胞是否存活?；罴?xì)胞不會被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會被染成淡藍(lán)色。臺盼藍(lán)可被巨噬細(xì)胞吞噬，故可用于巨噬細(xì)胞的活體染色劑。

3.6

知情同意 informed consent

供體對生物樣本（本文件中為“外周血”）捐贈(zèng)的目的和研究用途等明了和認(rèn)可。以生物樣本供體自愿同意參與為原則，以當(dāng)事雙方共同簽署知情同意書為具體體現(xiàn)。

3.7

脫氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid, DNA

染色體主要組成成分，同時(shí)也是主要遺傳物質(zhì)。

3.8

核糖核酸 ribonucleic acid, RNA

存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA 由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成的長鏈狀分子。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和堿基構(gòu)成。

4 總則

本文件采用密度梯度離心法進(jìn)行人 PBMC 的分離，此方法適用范圍廣、性價(jià)比高、結(jié)果穩(wěn)定。此外還有加速紅細(xì)胞沉降法、塑料吸附法、Colotta 法、分離管法等。這些方法分離的 PBMC 應(yīng)符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

5 實(shí)驗(yàn)原理

外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分離液作密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞密度大，離心后沉于管底；PBMC 的密度小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到PBMC。

6 實(shí)驗(yàn)方法

6.1 材料

6.1.1 主要設(shè)備：生物安全柜、低溫水平式離心機(jī)、血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、血細(xì)胞分離機(jī)等。

6.1.2 主要耗材：真空采血管（ACD/EDTA/肝素抗凝）、離心管、移液管、無菌吸頭、凍存管、巴氏吸管、移液器、輔助移液器、注射器、無菌棉球、鑷子、橡皮止血帶等。

6.1.3 主要試劑：RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO、淋巴細(xì)胞分離液（20 ℃時(shí)密度為1.077 ±0.001 g/ml）、臺盼藍(lán)染色液、碘酒、75% 酒精等。

注：培養(yǎng)基也可用無血清培養(yǎng)基和營養(yǎng)添加物替代。

6.2 步驟

6.2.1 PBMC 的采集

6.2.1.1 獲得供體知情同意后，按照 GB/T 38576-2020 常規(guī)無菌抽取新鮮外周血至 ACD/EDTA/肝素抗凝管中。

6.2.1.2 獲得供體知情同意后，使用血細(xì)胞分離機(jī)，按照操作手冊規(guī)范地采集；采集到的血液或細(xì)胞在采集、處理和運(yùn)輸過程中避免冷凍和冷藏，并盡快分離 PBMC。

6.2.2 PBMC 的分離

6.2.2.1 分離前的準(zhǔn)備：潔凈實(shí)驗(yàn)室（凈化等級不低于百萬級）的常規(guī)消毒，紫外燈照射潔凈間和生物安全柜，且保持臺面的整潔；準(zhǔn)備好本次分離所需無菌耗材、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO、淋巴細(xì)胞分離液等。淋巴細(xì)胞分離液和RPMI-1640 培養(yǎng)基應(yīng)提前置于室溫。

6.2.2.2 分離PBMC：取出無菌離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液；同時(shí)將所得外周血樣本用生理鹽水/PBS 等體積稀釋，并充分混勻，形成外周血的稀釋液；再將稀釋液加入到淋巴細(xì)胞分離液中，應(yīng)將稀釋液緩慢勻速地加至淋巴細(xì)胞分離液面之上，確保血液稀釋液和淋巴細(xì)胞分離液形成明顯分層（上層為血液稀釋液，下層為淋巴細(xì)胞分離液）。

6.2.2.3 室溫低速離心（500 ×，下同）20 min。

6.2.2.4 離心畢，可見離心管中液體形成明顯分層，從上到下依次為血漿與生理鹽水/PBS 混合液層、單個(gè)核細(xì)胞白膜層、人淋巴細(xì)胞分離液層及紅細(xì)胞層。用巴氏管或無菌吸頭小心吸取白膜層，置于新的離心管中，注意不要吸到淋巴細(xì)胞分離液；補(bǔ)充適量的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液，用移液管吹打均勻。

6.2.2.5 室溫低速離心10 min。

6.2.2.6 吸棄上清液，保留細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充適量的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液，輕柔且充分吹打均勻后，離心洗滌細(xì)胞：4 ℃低速離心5 min。

6.2.2.7 重復(fù)步驟6.2.2.6。

6.2.2.8 離心畢，吸棄上清液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

6.2.2.9 將PBMC 按照一定密度種入培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，也可將PBMC 凍存?zhèn)溆谩?/p>

6.2.3 PBMC 的凍存和復(fù)蘇

6.2.3.1 進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)算得到的 PBMC 總數(shù)，計(jì)算凍存所需管數(shù)。

6.2.3.2 取出所需數(shù)量凍存管，標(biāo)記好細(xì)胞編號、細(xì)胞總數(shù)和凍存日期。

6.2.3.3 配制凍存液。

6.2.3.4 在 PBMC 細(xì)胞沉淀中加入一定體積配制好的細(xì)胞凍存液，輕柔且充分吹打均勻；將吹打均勻的細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，1 ml 凍存液可用于5 × 105~ 5 × 106個(gè)細(xì)胞的凍存。

6.2.3.5 常規(guī)將細(xì)胞程序性降溫。

注：某些細(xì)胞凍存液無需程序性降溫。

6.2.3.6 將經(jīng)過程序性降溫的凍存管轉(zhuǎn)入液氮容器中，并記錄好細(xì)胞凍存管放置的位置。

6.2.3.7 PBMC 復(fù)蘇時(shí)，提前將復(fù)蘇設(shè)備預(yù)熱至37 ℃，操作人員注意做好防護(hù)，迅速從液氮中取出所需管數(shù)細(xì)胞，將凍存管輕輕放入復(fù)蘇設(shè)備，使細(xì)胞快速融化。

6.2.3.8 在無菌離心管中加入適量的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞凍存管中細(xì)胞懸液吸出置于離心管中，室溫低速離心10 min，計(jì)數(shù)，按一定密度接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。

注：完全培養(yǎng)基指的是90% 培養(yǎng)基+ 10% 胎牛血清。

6.2.4 用于 RNA 抽提的 PBMC 預(yù)處理

6.2.4.1 將含有 PBMC 的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，室溫低速離心。

6.2.4.2 離心畢，去掉上清，加入適量 PBS 小心將細(xì)胞沉淀吹打均勻，室溫低速離心。

6.2.4.3 重復(fù) 6.2.4.2 操作兩次。

6.2.4.4 將細(xì)胞重懸浮于RNA 保護(hù)液中，轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管中。4 ℃可保存1 ~ 3 天，–20 ℃ 可保存30 天左右，如需長期保存，請置于–80 ℃冰箱或液氮罐中。

6.2.4.5 RNA 抽提時(shí)，將保存PBMC 的離心管從存儲設(shè)備中取出，恢復(fù)至室溫后，立即進(jìn)行RNA抽提。

6.2.5 用于 DNA 或蛋白抽提的 PBMC 預(yù)處理

6.2.5.1 將含有 PBMC 的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，室溫低速離心。

6.2.5.2 離心畢，去掉上清，加入適量 PBS 小心將細(xì)胞沉淀吹打均勻，室溫低速離心。

6.2.5.3 重復(fù) 6.2.5.2 操作一次。

6.2.5.4 加入適量 PBS 緩沖液將細(xì)胞沉淀吹打均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管，室溫低速離心。

6.2.5.5 去掉上清，將細(xì)胞沉淀 –80 ℃凍存。

6.2.5.6 DNA 抽提時(shí)，將保存PBMC 的離心管從存儲設(shè)備中取出，待細(xì)胞沉淀融化后，立即進(jìn)行DNA 抽提。蛋白抽提時(shí)，將保存PBMC 的離心管從存儲設(shè)備中取出，置于冰上，待細(xì)胞沉淀融化后，立即進(jìn)行蛋白抽提。

7 質(zhì)量控制

7.1 活細(xì)胞計(jì)數(shù)

7.1.1 總則

選擇合適的活細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，常用的有臺盼藍(lán)染色等方法。

7.1.2 臺盼藍(lán)染色方法

將細(xì)胞沉淀用RPMI-1640 培養(yǎng)基補(bǔ)充，充分吹打均勻后，用精確量程的移液器吸取適量細(xì)胞懸液，置于EP 管中，隨之在EP 管中加入適量臺盼藍(lán)，使其終濃度為0.04%，充分混勻，臺盼藍(lán)染色3 min，取適量細(xì)胞懸液勻速加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)：分別計(jì)數(shù)四大格未染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)和染成藍(lán)色的細(xì)胞總數(shù)，將結(jié)果記錄在專用計(jì)數(shù)本上。利用如下公式計(jì)算分離所得PBMC 總數(shù)和存活率：

注：X：細(xì)胞總數(shù)；Y：四大格染成藍(lán)色細(xì)胞總數(shù)；N：四大格細(xì)胞總數(shù)；n：細(xì)胞懸液稀釋倍數(shù)；v：細(xì)胞懸液總體積；S：細(xì)胞存活率（%）。

7.2 RNA 的質(zhì)量控制

應(yīng)對RNA 的濃度、純度與完整性進(jìn)行質(zhì)量檢測。

7.2.1 RNA 的濃度可使用分光光度、熒光染料等方法進(jìn)行檢測。

7.2.2 RNA 的純度可使用分光光度、瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行檢測。

7.2.3 RNA 的完整性可使用微流控分析、瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行檢測。

7.3 DNA 的質(zhì)量控制

應(yīng)對DNA 的濃度、純度與完整性進(jìn)行質(zhì)量檢測。

7.3.1 DNA 的濃度可使用分光光度、熒光染料等方法進(jìn)行檢測。

7.3.2 DNA 的純度可使用分光光度、瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行檢測。

7.3.3 DNA 的完整性可使用瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行檢測。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016