磁化水灌溉對鎘脅迫下歐美楊Ⅰ-107苗期氮素營養(yǎng)代謝的影響

張志浩 孔令剛 朱 紅 畢思圣 王華田 孟詩原 劉秀梅

(1山東農業(yè)大學/黃河下游森林培育國家林業(yè)局重點實驗室，山東 泰安 271018； 2 濟南市林業(yè)科技推廣站，山東 濟南 271100；3廣州市林業(yè)和園林科學研究院，廣東 廣州 510405；4上海市環(huán)境學校，上海 200135)

生物磁學已在醫(yī)學、環(huán)保、農業(yè)及生物工程等領域得到了廣泛應用[1]。近年來，國內外關于磁現(xiàn)象在種子處理、作物抗逆性以及土壤質量改善等領域開展了大量研究與應用，并在促進種子萌發(fā)、增強抗逆性以及提高作物產(chǎn)量和品質等方面取得了一定的研究成果。研究發(fā)現(xiàn)，磁化水易進入細胞，促進細胞新陳代謝，增強細胞活力，從而促進種子萌發(fā)與幼苗生長，并提高作物產(chǎn)量。如，利用磁化水浸種或灌溉幼苗，不僅可以提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及產(chǎn)量和品質[2-4]，而且可以提高α-淀粉酶和蛋白酶等代謝酶的活性[5]。此外，磁化水能增加生物膜的滲透性，改善植物對營養(yǎng)物質的吸收，并提高植物抗逆性[6-8]。研究表明，磁化作用改變了水的pH 值、電導率及硬度等特性，這有利于無機鹽類的溶解[9-11]，從而為植物生長提供有利的環(huán)境條件。

鎘(Cd)是一種廣泛分布的重金屬元素，易被植物吸收并累積，是植物生長的非必需元素，可改變植物的多種生理過程，干擾植物新陳代謝，影響植物的生長和發(fā)育[12-15]。另外，Cd 脅迫會影響植物對氮素的吸收、轉運和分配[16]，導致植株和籽粒中營養(yǎng)元素組成的變化。由此可見，Cd 的存在不僅影響植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用，而且可形成Cd 與養(yǎng)分同時限制植物生長的惡性循環(huán)[17]。但由于研究材料、試驗設計以及Cd處理濃度的差異導致所得研究結果不同，目前，關于植物養(yǎng)分代謝對Cd 脅迫的響應機理尚不明確。Cd 脅迫條件下，磁化水灌溉對植株生長以及耐Cd 能力均有一定的促進作用。張瑛等[18]發(fā)現(xiàn)磁化處理可以增加楊樹幼苗中光合色素的含量，減輕Cd 脅迫對光合機構的傷害，促進植株生物量的累積，增強楊樹對Cd 的耐受能力。Chen 等[19]發(fā)現(xiàn)，磁化處理降低了Cd 脅迫下綠豆(Vigna radiate)幼苗體內H2O2、O2-、丙二醛含量以及電解液外滲量，提高了一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)活性，以及提高了植株的光合特性。上述研究結果初步證明了磁化水可減輕Cd 對植物的傷害。因此，本研究以歐美楊I-107(Populus×euramericanaNeva)為試材，通過外源Cd 的添加，探索磁化水灌溉對楊樹氮素吸收、轉化與代謝的影響；通過對銨 態(tài) 氮(ammonium nitrogen， NH4+-N)、 硝 態(tài) 氮(nitrate nitrogen， NO3--N)和全氮(total nitrogen， TN)含量、氮代謝酶活性、游離氨基酸代謝以及根系形態(tài)指標的測定，闡明磁化水對Cd 脅迫后楊樹營養(yǎng)代謝的影響以及歐美楊Ⅰ-107 作為林木修復樹種在Cd 污染土壤中栽培的作用，以期為重金屬污染土壤的修復和改良提供新的思路和可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

盆栽試驗于2017年3 ―5月在山東農業(yè)大學林學試驗站(117°08′E，36°11′N)日光溫室內進行，其面積為400 m2，溫度為20 ～25℃，相對濕度為60% ～70%，光合量子通量密度為800 ～1 000 μmol.m-2.s-1。試驗材料為1年生歐美楊Ⅰ-107，采自山東農業(yè)大學歐美楊Ⅰ-107 采穗圃。

1.2 試驗設計

3月下旬選取1年生歐美楊Ⅰ-107 苗干中段直徑為1．5±0．1 cm、長度為12．0 cm 的插穗扦插于營養(yǎng)袋(20 cm×22 cm)內，栽培基質為珍珠巖，每盆扦插2株，前期進行統(tǒng)一水分管理，于發(fā)芽后澆灌1/2 改良Hoagland 營養(yǎng)液。同年4月初待小苗生長穩(wěn)定后，選取長勢均勻的小苗進行Cd 脅迫處理。

以Cd(NO3)2.4H2O 作為Cd 源，溶解于1/2 改良Hoagland 營養(yǎng)液中用于磁化和非磁化水灌溉。試驗共設置4 個處理，分別為磁化100 μmol?L-1Cd(NO3)2.4H2O灌溉處理(M100)、非磁化100 μmol?L-1Cd(NO3)2.4H2O灌溉處理(NM100)、磁化0 μmol?L-1Cd(NO3)2.4H2O 灌溉處理(M0)、非磁化0 μmol?L-1Cd(NO3)2.4H2O 灌溉處理(NM0)。磁化處理組利用U050 磁化裝置(United Arab Emirates Branch， 俄羅斯)處理灌溉溶液，磁化器出水量為5 m3.h-1，磁場強度為300 Gs。

采用隨機區(qū)組試驗設計，每小區(qū)6 盆，重復5 次。每隔5 d 灌溉一次，每盆灌溉用水量為200 mL；30 d 后取中上部幼嫩葉片和新生細根，部分細跟4℃保存，用于根系形態(tài)測定，另一部分用去離子水沖洗干凈后，于-80℃保存，用于氮素含量、氮代謝酶活性以及游離氨基酸合成量的測定。每處理至少重復測定3 次。

1.3 測定項目與方法

1．3．1 NO3--N、NH4+-N 和TN 含量測定 NO3--N 含量采用水楊酸-硫酸法測定[20]；NH4+-N 含量采用水合茚三酮法測定[21]；TN 含量采用凱氏定氮法測定[21]。

1．3．2 酶活性測定 硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)活性和亞硝酸還原酶(nitrite reductase，NiR)活性采用張瑛等[22]的方法測定；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸合成酶(glutamate synthetase，GOGAT)活性采用王小純等[23]的方法測定。

1．3．3 游離氨基酸含量測定 半胱氨酸(cysteine，Cys)、谷氨酸(glutamate，Glu)、谷氨酰胺(glutamine，Gln)以及甘氨酸(glycine，Gly)采用高效液相色譜法測定[24]。

1．3．4 根系形態(tài)測定 利用WinRHIZO PRO 2007 根系分析軟件對根系長度、根表面積、平均直徑、根體積以及不同徑級根長和根尖數(shù)等形態(tài)學參數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013 和SAS 9．0 進行數(shù)據(jù)處理，利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 新復極差法(Duncan’s multiple-range)進行差異顯著性分析(P＜0．05)。

2 結果與分析

2.1 楊樹葉片和根系中氮素含量變化

由圖1 可知，Cd 脅迫后(M100、NM100) 葉片中NH4+-N、NO3--N 及TN 含量較M0和NM0顯著降低，且NH4+-N 含量下降比例最大，為61．3%～64．0%。磁化水灌溉處理均有利于葉片中氮素含量的積累，與NM0相比，M0葉片的NH4+-N、NO3--N 及TN 含量均提高；與NM100相比，M100葉片中3 種形態(tài)氮含量提高4．1%～53．5%；此外，磁化水灌溉與非磁化水灌溉葉片中NH4+-N 和NO3--N 含量差異均達顯著水平(P＜0．05)，且磁化水灌溉中NH4+-N 含量提高比例較大，為53%～66%。

根系中氮素含量變化與葉片中表現(xiàn)略有不同(圖1)。與M0和NM0相比，Cd 脅迫后(M100、NM100)，根系中NH4+-N 和NO3--N 含量顯著下降(P＜0．05)，且NH4+-N 含量下降比例較大，平均降低43．1%；TN含量變化則相反，Cd 脅迫后TN 含量均提高，且M100較M0顯著提高(P＜0．05)。與非磁化水灌溉處理相比(NM0、NM100)，磁化水灌溉處理(M0、M100)提高了NH4+-N 和TN 在根系中的累積。其中，NH4+-N 含量提高比例最大，呈顯著差異水平；TN 含量提高比例相對較小，但M100與NM100根系中TN 含量的差異仍達顯著水平(P＜0．05)；與NH4+-N 和TN 變化趨勢相反，與非磁化水灌溉處理(NM0、NM100)相比，磁化水灌溉處理(M0、M100)后根系中NO3--N含量顯著降低(P＜0．05)，且Cd 脅迫后降低比例較大。

圖1 磁化水灌溉對Cd 脅迫下楊樹葉片和根系中NH4+-N、NO3--N 以及TN 含量的影響Fig.1 Changes in the contents of ammonium nitrogen (NH4+-N), nitrate nitrogen (NO3--N), and the total nitrogen (TN) in the leaves and roots, respectively, of Neva after irrigating with magnetic or non-magnetic treatment of water under cadmium stress

2.2 楊樹葉片和根系中氮代謝酶活性變化

由圖2 可知，與M0和NM0相比，Cd 脅迫(M100、NM100)對葉片中不同氮素代謝酶的活性影響不同。Cd 脅迫誘導NR、GS 活性提高。NiR 活性則相反，Cd脅迫后略有降低，但下降幅度較小。與非磁化水灌溉處理(NM0、NM100)相比，磁化水灌溉處理(M0、M100)后刺激氮代謝酶活性提高，且GS 和GOGAT 活性差異達顯著水平。

Cd 脅迫下，根系中不同氮素代謝酶對Cd 脅迫的反應不同(圖2)。Cd 脅迫提高了NR、GS 活性，且對NR 活性的促進作用最強，平均提高29．0%，對NR 和GS 活性有顯著影響(P＜0．05)；Cd 脅迫對NiR 有抑制作用，但其活性變化較小。與非磁化水灌溉處理(NM0、NM100)相比，磁化水灌溉處理(M0、M100)有利于提高NR、GS 活性，且磁化水灌溉后根系中GS 活性提高比例最大，平均提高52．2%。NiR 和GOGAT 活性則與之相反，磁化處理后其活性降低，但差異較小。

2.3 楊樹葉片和根系中游離氨基酸含量變化

通過對葉片中游離氨基酸含量(Cys、Glu、Gln、Gly)分析可知(圖3)，Cd 脅迫(M100、NM100)后，葉片中Cys、Gln 和Gly 含 量 較M0和NM0顯著降 低(P＜0．05)；其中，Cd 脅迫后楊樹葉片Gly 含量降低比例最大，平均降低61．2%。但Cd 脅迫后有利于Glu 含量的積累，Cd 脅迫處理較非Cd 處理顯著提高4%～201%。與非磁化水灌溉處理(NM0、NM100)相比，磁化水灌溉處理(M0、M100)提高了葉片中Cys 和Gln 含量，但抑制了Glu 和Gly 的合成；且磁化水灌溉后葉片中Cys 含量提高比例最大，平均提高104．8%，而Gly 含量降低比例最小，平均降低48．2%。

圖2 磁化水灌溉對Cd 脅迫下楊樹葉片和根系中硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)以及谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影響Fig.2 Changes in the enzyme activities of nitrate reductase (NR), nitrite reductase (NiR), glutamine synthetase (GS) and glutamate synthase (GOGAT) in the leaves and roots, respectively, of Neva after irrigating with magnetic or non-magnetic treatment of water under cadmium stress

Cd 脅迫條件下，根系中不同種游離氨基酸含量變化表現(xiàn)不同。與M0相比，M100根系中Cys、Glu、Gln 和Gly 含量均提高，Cys 含量提高幅度最大，Gln 含量變化幅度較小。與非磁化水灌溉處理(NM0、NM100)相比，磁化水灌溉處理(M0、M100)根系中Cys、Glu、Gln 和Gly含量均提高；其中，Cys 含量變化較??；而Gly 含量提高比例最大，平均提高18．8 倍。

2.4 楊樹根系形態(tài)指標變化

通過對楊樹根系形態(tài)指標(根系長度、根表面積、平均直徑、根體積、根尖數(shù)、≤1．5 cm 短根數(shù)量分析可知(表1)，與M0相比，M100的根系長度、根表面積、平均直徑、根體積和根尖數(shù)均降低；但短根數(shù)量提高18．8%。NM100的根系長度、根表面積、根體積和短根數(shù)量均較NM0提高，但平均直徑和根尖數(shù)則降低。另外，磁化水灌溉處理后楊樹根系形態(tài)指標升高，且根尖數(shù)的提高幅度最大。

3 討論

3.1 磁化水灌溉對Cd 脅迫條件下楊樹根系形態(tài)特性的影響

根系形態(tài)性狀會因植物環(huán)境變化而改變。研究發(fā)現(xiàn)，磁化水灌溉有利于Cd 脅迫條件下根系形態(tài)發(fā)育(表1)，有利于楊樹根系建成，對根系長度、根表面積、平均直徑、根體積、根尖數(shù)、短根數(shù)量等均有促進作用。Meng 等[25]發(fā)現(xiàn)外源不同濃度的植物生長調節(jié)劑可促進Cd 脅迫下油菜(Brassica napusL．)根系伸長生長，Xu 等[26]發(fā)現(xiàn)外源施入100 μmol.L-1硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)可有效維持Cd 脅迫下蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)幼苗質膜的完整性，降低其對Cd的吸收并促進其根系生長；本研究結果與之相似，說明在Cd 脅迫下，楊樹將植物體有限的資源分配到根系中，促進根系的生長，以提高對逆境脅迫的適應能力[27-28]。另外，磁化水灌溉能夠維持良好的根系形態(tài)性狀從而有利于水分和養(yǎng)分的吸收，這表示磁化水灌溉處理對Cd 脅迫后楊樹根系的生長發(fā)育起到了一定的保護作用。

表1 Cd 脅迫下磁化與非磁化水灌溉后楊樹根系形態(tài)指標變化Table 1 Changes in roots morphological characteristics of Neva when irrigating with magnetic or non-magnetic treatment of water under cadmium stress

3.2 磁化水灌溉對Cd 脅迫條件下楊樹氮代謝的影響

氮素是植物必需營養(yǎng)元素之一，氮素代謝也是植物生命活動的基本過程[29]。NH4+-N 和NO3--N 是植物從土壤中吸收的主要氮素形態(tài)，其中NO3--N 可直接被植物吸收利用[30-31]。NR 和NiR 活性高低在初級氮同化調控中起著非常重要的作用，顯著影響植物的生長發(fā)育[32]。研究表明，Cd 脅迫提高了楊樹葉片和根系的NR 活性，抑制了NiR 活性；同時楊樹體內TN含量提高，磁化處理后葉片中較高的TN 含量可以保證葉片的生產(chǎn)性能。

磁化作用誘導葉片中NO3--N 含量提高，但在根系中其含量降低；另外，根系中的NH4+-N 含量高于葉片；同時，磁化作用提高了葉片和根系中的NR 活性，且葉片中NR 活性是根系的4 ～5 倍；葉片NiR 活性是根系的2 倍多。一方面是因為，磁化作用下，楊樹根系吸收的NH4+不能直接運輸?shù)饺~片，而根系中NO3-向葉片中優(yōu)先運輸，從而使根系中NO3-含量降低而葉片中升高；NO3-是誘導NR 和NiR 活性的主要信號，一定范圍內，NR 和NiR 活性主要取決于營養(yǎng)物質中NO3-濃度；磁化作用誘導楊樹葉片中充足的NO3-供應，其對NR 和NiR 活性皆有促進作用[33]。另一方面，磁化水灌溉處理提高了葉片中的NR 和NiR 活性，有利于硝酸鹽向亞硝酸鹽的轉化；且葉片中NiR 活性的提高可以避免亞硝酸鹽累積造成對葉片組織的毒害；根系中NiR 活性降低為氨基酸的合成提供原料物質。

3.3 磁化水灌溉對Cd 脅迫條件下楊樹游離氨基酸合成與轉化的影響

GS-GOGAT 循環(huán)是銨離子同化的主要途徑之一，銨的同化不僅可以解除銨離子對植物組織的毒害作用，而且能夠滿足植物對氮營養(yǎng)的需求[34]。GS 是GSGOGAT 循環(huán)中氮代謝中心的關鍵酶，對植株體內氮同化和代謝效率有重要影響[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫會抑制GS-GOGAT 循環(huán)效率[37]；而磁化水灌溉會誘導葉片和根系中GS 活性提高，可促使GS 與大量NH4+結合生成Gln，起到緩解銨毒和補充Glu 的作用[38]。另外，磁化作用誘導根系組織中Glu、Gln 和Gly 含量顯著提高，其中Gly 平均合成量為非磁化水灌溉處理的18 倍左右，這可能是由于磁化水灌溉處理加速了根中的GS 和GOGAT 循環(huán)，加快了NH4+同化，使得氨基酸含量增加，同時提高了葉片NR 活性，加快硝態(tài)氮的轉化速率。

Cd 脅迫下，磁化作用誘導根系中Cys、Gln、Glu 和Gly 四種游離氨基酸含量顯著上升，說明磁化作用可通過調節(jié)組織氨基酸代謝以緩解高濃度Cd 富集造成的根系損傷以及離子穩(wěn)態(tài)失衡等生理傷害；氨基酸作為NO3--N 還原后的同化產(chǎn)物，對氮代謝具有反饋調節(jié)作用，值得注意的是，磁化水灌溉后根系中Gly 合成量提高、NO3--N 濃度降低以及TN 含量的增加，可以使植株各部位累積的碳水化合物即碳架得到合理和高效利用，Cd 脅迫條件下，磁化水灌溉處理提高了葉片中的Cys 含量，可為蛋白質的合成提供原料物質；磁化作用下，較高的GS 活性對Glu 的需求量增多，消耗更多的Glu 以合成Gln，從而造成Glu 合成量降低；Glu與Gln 相比增加比例較大，這可能是Gln 對NH4+的蓄積能力較強，對解除游離銨毒害中起一定作用；而關于磁化作用誘導葉片中Gly 合成量降低的原因Gly 與其他游離氨基酸之間的作用關系及其在氮同化中的作用則有待進一步研究。

4 結論

研究結果表明，磁化水灌溉有利于Cd 脅迫下楊樹根系形態(tài)的建成；另外，磁化水灌溉改變了楊樹葉片和根系中氮素營養(yǎng)的吸收和轉運，對促進葉片和根系中氮素代謝以及降低亞硝酸鹽的累積有明顯效果；進而提高了楊樹對Cd 脅迫環(huán)境的適應能力。但目前本研究僅是盆栽基質栽培試驗，與實際生產(chǎn)過程中所得試驗效果存在一定的差異，今后還需在大田條件下進一步揭示磁化水灌溉條件下楊樹對Cd 污染土壤的適應機理。