手性除草劑2甲4氯丙酸對映體在擬南芥中吸收轉運及亞細胞分布的差異研究

常江海 郭 維 鄭姚穎 張素芬 葉慶富

(浙江大學原子核農(nóng)業(yè)科學研究所/農(nóng)業(yè)部核農(nóng)學重點實驗室，浙江 杭州 310029)

除草劑在世界范圍內(nèi)的使用量已居于各大農(nóng)用化學品的首位，其中約40%的品類具有手性結構[1]。手性除草劑雖然具有相同的理化性質(zhì)，但其在生理代謝、毒理學及環(huán)境化學等方面都有可能表現(xiàn)出較大的對映體選擇性差異[2-4]。具有手性的除草劑對映體在施用于靶標植物時，通常會被選擇性地識別和互作，從而產(chǎn)生具有對映體選擇性特征的吸收、分布、轉運、代謝及作用機理上的差異[2，4-6]。

手性除草劑2 甲4 氯丙酸(mecoprop，以下簡稱MCPP)是一種常用的苯氧羧酸類激素型內(nèi)吸性除草劑，具有一個手性中心，兩個相應對映體構型(R/S)[7-8]。MCPP 多用于防治谷類作物苗后早期的雙子葉雜草[8]。精2 甲4 氯丙酸(即mecoprop-P)與典型激素型除草劑2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、2 甲 4 氯(2-methyl - 4-chlorophenoxy acetic acid，MCPA)等具有相同的作用模式。經(jīng)雙子葉植物內(nèi)吸后，這一類型的除草劑通過“模仿”植物內(nèi)源生長激素吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid，IAA)的作用，在細胞核內(nèi)產(chǎn)生相較于內(nèi)源生長素更強且更持久的基因水平上的調(diào)控[4]，引發(fā)與乙烯(ehtylene)、脫落酸(abscisic acid，ABA)合成相關的下游基因持續(xù)表達，產(chǎn)生過量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和氰化物(cyanide)，破壞植物的激素平衡，紊亂正常生理代謝，加速衰老與死亡[9-13]。經(jīng)證實，這些除草劑和IAA 一樣，能引起相同類型的植物反應，但具有長效性和相對較高的活性，這是由于它們在植物中具有較高的穩(wěn)定性，而內(nèi)源植物激素，如IAA 在植物中可通過結合或降解等多重路徑導致失活較快。屬于非活性部分的S-MCPP，其除草活性強度遠小于其R 型對映體[8]，而目前對產(chǎn)生這種對映體除草活性顯著差異的具體原因尚未明晰。MCPP 的2 個對映體在雙子葉植物中的遷移規(guī)律和亞細胞水平分布上呈現(xiàn)對映體選擇性，這是判斷藥效能否發(fā)揮的先決因素，也是綜合評估二者除草活性差異的重要條件之一[14-17]。因此，本研究以雙子葉模式植物擬南芥為試驗對象，研究MCPP對映體在擬南芥中的吸收轉運和在亞細胞水平分布的比率差異，為更全面地了解以MCPP 為代表的手性激素類除草劑對靶標雙子葉植物毒性的對映體選擇性行為與效應，研發(fā)新型高效、低毒副作用的環(huán)境友好型單一光學活性除草劑提供依據(jù)[18-19]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗受試植物采用野生哥倫比亞型擬南芥(Arabidopsis thaliana)。試驗所用14C-MCPP[14C-2-(4-chloro-2-methylphenoxy)propanoic acid]2 個類型對映體購自上海啟甄同位素標記合成中心，結構如圖1所示，比活度為S 型：6．14×108Bq.mmol-1，R 型：5．64×108Bq.mmol-1，二者化學純度、放射性純度及對映體比率(enantiomeric ratio，Er)均高于99%，2 種供試藥劑用添加助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的10%丙酮-水溶液溶解，配置成40 mg.L-1母液。母液稀釋成指定的試驗濃度后，將2 種待測混合劑置于 Tricarb - 2910TR 液體閃爍計數(shù)器(PerkinElmer，USA)中測定放射性活度，確定施藥的放射性活度總引入量Aa。

1.2 試驗設計

將供試擬南芥種子4℃春化2 d 后，在黑土∶蛭石配比為1 ∶1(v ∶v)的無菌培養(yǎng)箱中短日照培養(yǎng)20 d(光照時間為10 h.d-1)。20 d 后，選取一批處于8 ～9 葉期，長勢與重量相近的植株，進行施藥試驗。如圖2 所示，擬南芥生長初期的蓮座葉以順時針或逆時針為序依次長出，相鄰生長葉片之間的角度為100°～140°。規(guī)定編號4～6 的葉片為標記葉；編號1～3 的初生葉片及子葉和座薹莖為標記下位；編號7 ～9 的葉片及座薹莖上的少量初生葉為標記上位。分別用2 種14C-MCPP配制成3．0×10-5mol.L-1的濃度后對標記葉進行涂抹，每株標記葉片為編號4 ～6 三片，平均每片葉片均勻涂抹3．0 μL，共施藥9．0 μL，平行重復3 次。

1.3 測定項目及方法

圖1 14C-R-MCPP 與14C-S-MCPP 結構示意圖Fig.1 Structure of 14C-R-MCPP and 14C-S-MCPP

圖2 擬南芥9 葉期葉序俯視圖(生長次序為1～9 逆時針輪生)Fig.2 Top view of phyllotaxis of Arabidopsis thaliana in 9 leaf stage

1．3．1 吸收轉運 分別于施藥后6、12、24、48、72、144 h 進行取樣，每個時間段平行取樣的樣本數(shù)為8，取樣前先用去離子水淋洗葉片，回收未被植株吸收的藥物。將全植株分為標記葉位點、標記上位、標記下位、根部四部分，置于60℃烘箱殺青，在OX-600 生物氧化燃燒儀(Rj Harvey Instrument Co．NJ，美國)中燃燒4 min，燃燒產(chǎn)生的14CO2用15 mL 的閃爍液B 吸收，閃爍液 B配方：5g2，5-二苯基惡唑(2， 5-diphenyloxazole， PPO)，0．5 g 1，4-[2-(5-苯基惡唑)][(1， 4-bis - 5-phenyloxazole - 2-yl)-benzene，POPOP]，350 mL 乙二醇乙醚，650 mL 二甲苯，之后用液體閃爍計數(shù)器(Beckman Coulter Diagnostics， 美國)測量各樣本中的放射性活度。按公式計算吸收率(Ra)和轉運比率(Rt)：

式中，Ap表示某時刻測得的植株中的總14C 放射性活度，Aa表示引入植株的14C 總放射性活度。

式中，Ai表示t時刻植株i組分的14C 活度，Apt表示同時刻植株的14C 總放射性活度，當i組分為標記葉時，該比率代表的是t時刻的標記葉殘留率Rt。

1．3．2 亞細胞分布 亞細胞分布試驗參照文獻[20-22]，采用分步差速離心法。將1．3．1 中各時段取樣后的標記葉收集起來，遴選其中新鮮完整、顏色較深的葉片，用剪刀剪碎成適量大小，稱取0．30 g，加入12 mL亞細胞提取液(0．25 mmol.L-1蔗糖，1 mmol.L-1二硫代赤蘚醇，50 mmol.L-1Tris-HCl 緩沖液，pH 值7．5)，在勻漿器內(nèi)研磨均勻后，將勻漿倒入離心管中，于4℃條件下300 r.min-1離心30 s，沉淀為細胞壁部分，主要組分為細胞壁和細胞壁碎片。然后將上清液于1 500 r.min-1離心10 min，得到的沉淀物為細胞器部分(其中包括細胞核、葉綠體、有色體和白色體等)，得到的上清液為胞漿組分。將上述步驟獲得的細胞壁和細胞器分別冷凍干燥除去水分后，分別在生物氧化燃燒儀中燃燒4 min，產(chǎn)生的14CO2用閃爍液B 吸收后在液體閃爍計數(shù)器中測量樣本中的放射性活度。胞漿組分用提取液稀釋成一定比例后直接用液體閃爍計數(shù)器測其放射性活度。將擬南芥標記葉位的葉肉組織細胞分為細胞壁、胞漿、細胞器3 個組分。按公式計算其分布利率(Rd)：

式中，Si表示t時刻i組分的14C 比活度，Ss表示該時刻所有組分的14C 比活度之和。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與繪圖，采用SPSS Statics 22 進行顯著性分析和方差分析。相同構型、不同時間與不同構型、相同時間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析Tukey LSD。

2 結果與分析

2.1 擬南芥對2 種14C-MCPP 對映體的吸收動態(tài)

在施藥后的處理期間每天觀察施藥擬南芥的長勢，發(fā)現(xiàn)2 種藥物處理后的擬南芥長勢并無明顯差異，在標記葉葉片施藥處均有一定的輕微灼燒癥狀，可能是2 種藥物在施藥位點局部濃度過高導致的藥害。擬南芥對2 種構型的14C-MCPP 吸收情況如圖3 所示。分析統(tǒng)計結果表明，施藥后的藥物持續(xù)時間與藥物構型無顯著交互作用(P＞0．05)，擬南芥對2 種構型的14C-MCPP吸收差異顯著(P＜0．05)。14C-R-MCPP 對應的吸收率在施藥后6 ～24 h 隨時間變化差異顯著(P＜0．05)，在施藥48 ～144 h 內(nèi)則隨時間變化差異不顯著(P＞0．05)。而14C-S-MCPP 構型在施藥后6～12 h其吸收率隨時間變化差異顯著(P＜0．05)，施藥12 h之后則隨時間變化差異不顯著(P＞0．05)。表明擬南芥對14C-S-MCPP 吸收達到平衡的用時較14C-R-MCPP少，而穩(wěn)定后總體的吸收率較14C-R-MCPP 低4．79 個百分點。總體而言，擬南芥對2 種構型的14C-MCPP 達到平衡后的吸收率差異顯著(P＜0．05)，對14C-RMCPP 的吸收率更高。

圖3 14C-MCPP 吸收率Fig.3 14C-MCPP absorption rate

2.2 2 種14C-MCPP 對映體在擬南芥中的轉運分布

2 種14C-MCPP 對映體在擬南芥標記葉位點、標記上位、標記下位(不包括根)及根部位點的轉運分布數(shù)據(jù)如表1 及圖4 ～6 所示。2 種構型的14C-MCPP 在標記葉上位的分布情況如圖4 所示，14C-MCPP 對映體在標記上位的分布比率均隨時間的推移表現(xiàn)為顯著上升(P＜0．05)，除14C-S-MCPP 的分布比率在施藥后144 h相較施藥后72 h 的數(shù)值變化不顯著(P＞0．05)，推測14C-S-MCPP 的分布比率為1．21%時達到了峰值，相較之下14C-R-MCPP 的分布比率在施藥72 h 之后仍有緩慢上升的趨勢。在施藥后6 ～12 h，2 種14C-MCPP對映體在標記上位的分布水平相近，隨后的24 ～128 h14CR-MCPP 的分布比率均較14C-S-MCPP 高。

2 種構型的14C-MCPP 在標記葉下位的分布如圖5所示，施藥后0 ～72 h，14C-R-MCPP 在標記下位的分布比率隨時間的推移顯著增加(P＜0．05)，施藥后72 ～144 h，14C-R-MCPP 的分布比率升高并趨于穩(wěn)定(P＞0．05)。而14C-S-MCPP 在標記下位的分布比率在施藥后12～24 h 和48 ～72 h 階段隨時間變化差異不顯著(P＞0．05)，在施藥后72 h，隨時間推移增加的數(shù)值也較低，推測在施藥12 h 后，14C-S-MCPP 在標記上位的分布比率已經(jīng)穩(wěn)定。比較同時段2 種對映體在標記上位的分布比率可知，14C-R-MCPP 與14C-S-MCPP 在施藥后6～24 h 階段差異不顯著(P＞0．05)，在施藥24 h之后，14C-R-MCPP 在標記上位的分布比率均較14C-SMCPP 顯著提高(P＜0．05)。

圖6 顯示了2 種14C-MCPP 對映體在擬南芥根部的分布情況。14C-R-MCPP 在擬南芥根部的分布比率隨時間的推移顯著升高(P＜0．05)，而14C-S-MCPP 在根部的分布比率則隨時間的變化不顯著(P＞0．05)。在擬南芥體內(nèi)轉運的14C-MCPP 需先經(jīng)過標記下位，才能到達根部，因而14C-MCPP 在根部的轉運分布情況較為復雜，穩(wěn)定后2 種14C-MCPP 對映體在根部的分布比率約維持在1．1%～1．5%，其中14C-R-MCPP 的分布比率約為14C-S-MCPP 的1．3 倍。

由表1 可知，施藥后6 ～12 h，14C-R-MCPP 在標記葉位的殘留比率與14C-S-MCPP 差異不顯著(P＞0．05)，施藥12 h 之后，14C-R-MCPP 在標記葉位的殘留比率較14C-S-MCPP 顯著降低(P＜0．05)。標記葉位14C-S-MCPP 的殘留比率在施藥后144 h 與施藥后72 h 差異不顯著(P＞0．05)，說明標記葉位中的14C-SMCPP 在施藥72 h 之后處于幾乎不轉運的狀態(tài)；而標記葉位14C-R-MCPP 的殘留比率在施藥后144 h 與施藥后72 h 差異顯著(P＜0．05)，說明施藥72 h 之后的14C-S-MCPP 在標記葉中尚未達到轉運-殘留平衡，而施藥后144 h 殘留的、未轉運出的14C-R-MCPP 比率約為90．54%，低于14C-S-MCPP(95．41%)。

綜合以上各部位中2 種14C-MCPP 對映體的分布數(shù)據(jù)，14C-R-MCPP 的分布比率達到平衡所需時間普遍比14C-S-MCPP 更長，其分布比例也更高，這一點在向標記下位運輸時表現(xiàn)的更為明顯。

2.3 2 種14 C-MCPP 對映體在擬南芥中的亞細胞分布比率

圖7 為2 種構型的14C-MCPP 對映體引入擬南芥標記葉后在葉肉組織中亞細胞水平的分布比率。14CMCPP 的2 種構型在擬南芥標記葉位細胞中各組分的分布比率均為胞漿＞細胞壁＞細胞器。施藥后6 h，14CR-MCPP 與14C-S-MCPP 在胞漿、細胞器中的分布比例差異不顯著(P＞0．05)。施藥后144 h，14C-R-MCPP 在細胞壁的分布比率(28．74%)顯著低于14C-S-MCPP 在細胞壁中的的分布比率(39．60%)(P＜0．05)，說明一定時間內(nèi)擬南芥細胞壁對14C-S-MCPP 的固定能力較14C-R-MCPP 更強。相應地，施藥后144 h，14C-R-MCPP在擬南芥細胞器中達到平衡時的分布比率(10．55%)較14C-S-MCPP(4．11%)高(P＜0．05)，約為后者的2．6倍，說明擬南芥標記葉位的細胞中細胞器對14C-RMCPP 的富集作用較14C-S-MCPP 強。

表1 14C-MCPP 在標記葉位置的殘留比率Table 1 14C-MCPP residual ratio of labeled position

圖4 14C-MCPP 標記上位分布比率Fig.4 14C-MCPP distribution ratio of upstream on the labeled position

圖5 14C-MCPP 標記下位分布比率Fig.5 14C-MCPP distribution ratio of downstream on the labeled position

圖6 14C-MCPP 根部分布比率Fig.6 14C-MCPP distribution ratio in root

圖7 14C-MCPP 在標記葉中的亞細胞分布比率Fig.7 Subcellular distribution ratio of 14C-MCPP in labeled leaves

3 討論

植物可以通過共價結合、代謝降解等途徑，將內(nèi)源生長素的總體水平調(diào)控在一個穩(wěn)定的層次，但外源激素類除草劑的引入通常會與內(nèi)源生長素競爭結合，破壞激素水平的平衡，引發(fā)相關基因的超量響應和表達[4-5，11，23]。吸收比率更高，持效時間更長，與靶標受體結合能力更強的對映體構型顯然更具除草活性方面的優(yōu)勢。手性除草劑MCPP 的2 個對映異構體中，RMCPP 的除草活性是S-MCPP 的5～6 倍[8]。已有研究證實，在幾種典型雙子葉闊葉雜草中，S-MCPP 的降解半減期普遍比R-MCPP 短，表明S-MCPP 可能更容易被雙子葉闊葉植物降解，至于2 種構型在雙子葉植物中的吸收和運轉差異，尚不明確[24-25]。為更深入和全面地研究該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，本試驗以擬南芥作為受試雙子葉植物，探究MCPP 對映體在擬南芥中的吸收運轉及亞細胞分布是否存在對映體選擇性差異。綜合分析可知，在吸收效率上的差異可能并不足以成為產(chǎn)生除草活性差異的主要原因，而從轉運和分布角度來看，R-MCPP 自施用于標記葉并被吸收后，具有較高的轉運比率，尤其是在標記下位的分布比率上，R-MCPP的數(shù)據(jù)體現(xiàn)出該對映體在擬南芥中具有更高比例的轉運數(shù)值及更持久的轉運能力[26-27]。在亞細胞層次的分布上，施藥一定時間后，與14C-R-MCPP 相比，14C-SMCPP 在擬南芥葉肉細胞的細胞壁中占有較高的分布比率，且差異顯著。而在原生質(zhì)體內(nèi)的細胞液和細胞器中14C-R-MCPP 的分布比率則較14C-S-MCPP 高。細胞壁和細胞膜對不同手性14C-MCPP 對映體的選擇通透性差異以及2 種14C-MCPP 對映體在植物細胞中的移動能力差異可能是導致14C-MCPP 對映體在亞細胞水平分布差異的主要原因[28-29]。

本研究結果體現(xiàn)了擬南芥對引入的14C-R-MCPP 具有更強的吸收和運轉能力，并且在葉細胞細胞器中，14CR-MCPP 具有相對較高的分布比率。激素型除草劑，包括以MCPP 為代表的苯氧羧酸類藥物，主要作用于雙子葉植物葉肉細胞的細胞器中(包括細胞核)與內(nèi)源生長素IAA 競爭受體蛋白TIR1/AFBs 的結合位點[11-12]，紊亂植物體內(nèi)的激素調(diào)節(jié)，發(fā)揮除草功效。故2 種構型MCPP 與相關受體的結合能力和結合情況也是影響除草活性差異的關鍵，有待進一步研究探討。

4 結論

本研究結果表明，14C-MCPP 對映體在雙子葉模式植物擬南芥中的吸收、運轉及亞細胞分布存在一定的差異。與14C-S-MCPP 相比，14C-R-MCPP 在擬南芥莖葉中的轉運能力更強，其通過細胞壁的屏障，到達擬南芥中相應的生長激素類除草劑受體所在部位的比率也更高。結合之前已有研究報道的MCPP 對映體在雙子葉闊葉雜草中的降解速率差異等相關內(nèi)容，本研究從植物生理代謝角度多方面驗證了R-MCPP 具有對于雙子葉植物更強的除草活性，為探究不同手性苯氧羧酸類除草劑對映體除草活性的差異提供了數(shù)據(jù)支持。