鰹魚蒸煮液美拉德反應(yīng)優(yōu)化及氨基酸分析

陳啟航 方旭波 陳小娥 池海波 余 輝 田 方 王堅強

(1浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022； 2 浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 浙江 舟山 316021；3 浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司，浙江 舟山 316000)

鰹魚(Katsuwonus pelamis)俗稱炸彈魚，是一種具有較高經(jīng)濟效益的金槍魚，其產(chǎn)量約占世界主要金槍魚總產(chǎn)量的48%，低脂肪且富含蛋白質(zhì)[1-3]。在日本，以鰹魚食材為原料的調(diào)味品深受廣大消費者的青睞[4]。在我國，鰹魚魚柳和罐頭加工行業(yè)剛起步，其加工副產(chǎn)物鰹魚蒸煮液，營養(yǎng)豐富，富含水溶性蛋白質(zhì)、多肽等成分，但尚未得到有效利用，主要是由于其腥味較重，消費者不易接受。美拉德反應(yīng)指食品體系中含氨基化合物與含羰基化合物之間發(fā)生的非酶促反應(yīng)，能使食品產(chǎn)生愉快的香味和誘人的色澤[5-6]。在食品生產(chǎn)中將酶解技術(shù)和脫腥工藝相結(jié)合，并利用美拉德反應(yīng)賦予產(chǎn)品獨特的香味和良好的色澤，既能解決鰹魚蒸煮液腥味重的問題，也能為后續(xù)開發(fā)新型的鰹魚調(diào)味料提供研究基礎(chǔ)。

目前，調(diào)味料的風(fēng)味優(yōu)劣大多直接通過感官評價進行判定，易受測評人員的個人喜好影響，存在一定的主觀性和局限性[7]。電子鼻技術(shù)是通過傳感器陣列的響應(yīng)曲線來分析樣品的揮發(fā)性氣味，不僅可以識別各種不同的氣味，而且可對被測樣品中的成分進行定性分析，測定結(jié)果比感官評價更客觀，已在食品風(fēng)味表征中得到廣泛應(yīng)用[8-9]。周明珠等[10]利用電子鼻對不同保壓時間條件下的鱸魚氣味進行區(qū)分，發(fā)現(xiàn)不同保壓時間對鱸魚氣味影響不顯著；蒙萬隆等[11]應(yīng)用電子鼻技術(shù)檢測豬肉的揮發(fā)性氣味，能夠預(yù)測不同肥瘦配比豬肉的新鮮度；苗鈺湘等[12]利用電子鼻技術(shù)檢測不同貯藏時間下三疣梭子蟹肉的氣味變化，從而建立了測定三疣梭子蟹鮮度的方法。而利用電子鼻評價鰹魚蒸煮液在美拉德反應(yīng)條件下產(chǎn)生的風(fēng)味變化鮮有報道。

本試驗以經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的鰹魚酶解液為原料，利用美拉德反應(yīng)對酶解液進行呈色和增香，以感官評價和褐變程度為指標(biāo)，考察不同木糖和葡萄糖配比、加熱時間、溫度和pH 值對美拉德反應(yīng)的影響，同時采用電子鼻技術(shù)結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis， LDA)優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件[13-14]，并對優(yōu)化條件下的反應(yīng)產(chǎn)物進行氨基酸組成成分分析和必需氨基酸營養(yǎng)評價，以期為鰹魚蒸煮液的高值化應(yīng)用提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

-20℃貯存的鰹魚蒸煮液，蛋白質(zhì)含量為3．71%，浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶(1 ×105U.g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；D-木糖、D-葡萄糖，安徽酷爾生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海棱光技術(shù)有限公司；TGL-16C 低速大容量離心機，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠；PEN3 型便攜式電子鼻，德國Airsense 公司；UV-5900 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-50G 壓力蒸汽滅菌器，上海科曉科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1．3．1 工藝流程 鰹魚蒸煮液→酶解→滅酶→離心→酵母脫腥→美拉德反應(yīng)→濃縮→成品。

1．3．2 工藝要點 參照文獻[3]制備鰹魚酶解液，酵母發(fā)酵脫腥處理條件：0．75%的酵母添加量、在35℃條件下發(fā)酵60 min。

1．3．3 鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)單因素試驗 以添加還原糖1．0 g(木糖-葡萄糖配比分別為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1， m ∶m)、溫度(100、105、110、115、120℃)、反應(yīng)時間(30、40、50、60、70 min)、pH 值(5、6、7、8、9)作為單因素，研究不同因素對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響，其余各因素設(shè)定溫度110℃、加熱時間40 min、還原糖配比2 ∶1(m ∶m)、pH 值7．0，每組各做3次平行，以此確定美拉德反應(yīng)的最優(yōu)工藝條件，并對鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物進行電子鼻分析[7]。

1．3．4 鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)影響較大的3個單因素，進行正交試驗。正交試驗設(shè)計及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1．3．5 感官評定 選擇10 名食品專業(yè)的學(xué)生，針對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以滋味、色澤、氣味、形態(tài)四項指標(biāo)作為評價標(biāo)準(zhǔn)，對其進行感官評定，總分40 分，其中氣味、形態(tài)、滋味、色澤各10 分，分值越大，說明產(chǎn)物產(chǎn)生的風(fēng)味越好，結(jié)果是剔除異常數(shù)再取平均值，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評價表Table 2 The sensory evaluation table of Maillard reaction products

1．3．6 褐變程度測定 按文獻[15]的方法，將鰹魚酶解液稀釋25 倍后，于420 nm 波長處測定其產(chǎn)物的吸光度值，吸光度值即表示褐變程度。

1．3．7 電子鼻分析 將20 mL 鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物置于離心管中，密封，室溫下靜置40 min，進行電子鼻檢測分析[16]，每組做3 個平行。通過電子鼻的WinMuster 軟件，對采集到的樣品氣味信息進行PCA 和LDA[17]。

1．3．8 氨基酸營養(yǎng)評價 對美拉德反應(yīng)優(yōu)化后的產(chǎn)物進行氨基酸營養(yǎng)評價，參照王念民等[18]的方法計算氨基酸評分(amino acid score，AAS)和必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index，EAAI)，參照雷錦桂等[19]的方法計算氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient，RC)。氨基酸的測定： 色氨酸采用可見分光光度計法進行測定[20]，其余17 種氨基酸利用氨基酸自動分析儀分析[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗重復(fù)3 次。采用Origin Pro 8．5 軟件繪圖，SPSS 18．0 軟件進行正交試驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰹魚酶解液美拉德工藝優(yōu)化單因素試驗

2．1．1 木糖-葡萄糖配比對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響 還原糖是參與美拉德反應(yīng)的重要物質(zhì)，不同的還原糖種類會使美拉德反應(yīng)產(chǎn)生不同的風(fēng)味，其中核糖、木糖、葡萄糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味良好，但核糖的價格相對較貴，而木糖、葡萄糖廉價可行，操作簡單[22]，所以本試驗選擇葡萄糖和木糖。由圖1-A 和1-B 可知，當(dāng)木糖-葡萄糖配比為1 ∶2時，鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度最大，吸光度在420 nm 處達到最大值(0．676)，同時，感官評分也達到最高值(33．5 分)。由圖1-C 可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)貢獻率分別為98．54%和0．93%，主成分貢獻率之和為99．47%，說明主成分可以代表不同木糖-葡萄糖配比鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性氣味的主要特征信息。木糖-葡萄糖配比為1 ∶1、1 ∶2和2 ∶1條件下的橢圓位置接近，區(qū)分效果不明顯，需要進行進一步區(qū)分。由圖1-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為98．80%和1．03%，兩者累計貢獻率為99．83%。橢圓位置互不重疊，區(qū)分程度明顯，說明LDA 能夠很好地區(qū)分不同木糖-葡萄糖配比條件下鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味，區(qū)分度優(yōu)于PCA。此外，LDA 中，當(dāng)木糖-葡萄糖配比為1 ∶2時，橢圓與其他橢圓位置最遠，說明該條件下鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物品質(zhì)較優(yōu)。綜上所述，選擇木糖-葡萄糖配比為1 ∶2進行正交優(yōu)化試驗。

圖1 還原糖配比對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響分析Fig.1 Effect of reducing sugar ratio on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．2 溫度對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響 由圖2-A 和2-B 可知，溫度低于11℃時鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)隨著溫度的不斷升高，褐變程度也隨之增加，香味物質(zhì)不斷積累，感官評分也隨之增加；110℃后，溫度變化對褐變程度影響較小，且感官評分隨著溫度的升高而略有降低。由圖2-C 可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為97．85%和1．43%。其中，105℃和115℃之間相距較近，區(qū)分效果不太明顯，需進一步區(qū)分。由圖2-D 可知，PC1 貢獻率為66．07%，PC2 的貢獻率為33．39%，兩者貢獻率之和為99．46%，且橢圓位置互不重疊，說明不同溫度條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味通過LDA 能夠進行較好地區(qū)分。通過圖2-D 橫縱坐標(biāo)，結(jié)合圖2-A 和2-B 可知，100℃和120℃的橢圓位置與110、115 和105℃的橢圓位置有較大間距，可能是由于溫度過高或過低的影響。綜上所述，選擇溫度為110℃進行正交優(yōu)化試驗。這與劉安軍等[23]的研究結(jié)果相似。

圖2 溫度對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響分析Fig.2 Effect of temperature on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．3 反應(yīng)時間對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響 如圖3-A、B 所示，反應(yīng)前期，隨著鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)時間的延長，褐變程度逐漸增加，香味物質(zhì)也隨之產(chǎn)生。感官評分也隨著反應(yīng)的進行隨之增加；反應(yīng)過程中，由于葡萄糖和木糖不斷被消耗，褐變程度增加逐漸減緩；當(dāng)反應(yīng)時間超過40 min 后，美拉德產(chǎn)物會產(chǎn)生一定的焦糊味和其他異味，因此感官評分也逐漸降低。由圖3-C 可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為91．67%和5．40%。50 和60 min 的橢圓位置存在部分重疊，表明有相似揮發(fā)性成分，區(qū)分程度不太明顯。由圖3-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為95．03%和3．48%，兩者累計貢獻率為98．51%，且有各自的區(qū)域范圍，無重疊交叉，區(qū)分程度高。通過圖3-D 橫縱坐標(biāo)比較，結(jié)合圖3-B 可知，當(dāng)時間達到40 min 后，隨著時間的延長，感官評分逐漸降低。因此，選擇反應(yīng)時間為40 min 進行正交優(yōu)化試驗。這與王玉芬等[24]的研究結(jié)果相似。

2．1．4 pH 值對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響 由圖4-A、B 可知，pH 值增大會加快鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)進程，當(dāng)pH 值為7 時，在420 nm 波長處的吸光度值為0．696，達到最大值，感官評分為31．6 分。由圖4-C可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為77．73%和16．79%，總貢獻率為94．52%。pH 值7．0 和8．0 處的橢圓位置存在交叉，說明存在相似的揮發(fā)性成分，需進一步區(qū)分。由圖4-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為89．20%和9．17%，兩者累計貢獻率為98．37%，且橢圓位置互不重疊，說明能夠?qū)Σ煌琾H 值條件下的鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物風(fēng)味進行良好區(qū)分。結(jié)合圖4-A、B可得，pH 值過高或過低，都會影響香氣成分。因此，選擇pH 值為7。

圖3 反應(yīng)時間對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction time on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2.2 鰹魚酶解液美拉德工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果可知，木糖-葡萄糖配比(A)、溫度(B)以及反應(yīng)時間(C)對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)影響較大。由表3 可知，就褐變程度而言，各因素對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)影響的大小順序為A＞B＞C；由感官評分可知，各因素對美拉德反應(yīng)影響大小的順序為A＞C＞B。綜合木糖-葡萄糖配比、溫度、反應(yīng)時間3 個因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響，得出美拉德工藝最佳條件為A2B2C3，即木糖-葡萄糖配比為1 ∶2，溫度110℃，時間45 min，在此基礎(chǔ)上進行了驗證試驗，試驗平行3 次，結(jié)果表明，褐變程度A420分別為0．631、0．626、0．634，平均值為0．630，感官評分分別為34．7、35．0、35．1 分，平均值為34．9 分，其中感官評分高于表3 中的任一數(shù)據(jù)，說明正交試驗得到的美拉德工藝優(yōu)化參數(shù)具有適用性和可靠性。所得產(chǎn)物魚香味濃郁、口感細膩，色澤為黃棕色。

2.3 游離氨基酸組成成分分析及相關(guān)營養(yǎng)評價

由表4 可知，鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物中存在18 種氨基酸，氨基酸種類齊全，與鰹魚酶解液相比，其氨基酸含量減少較明顯的主要有苯丙氨酸(36．76%，減少百分比，下同)、組氨酸(31．07%)、半胱氨酸(25．72%)、絲氨酸(15．93%)，說明這幾種氨基酸是參與該美拉德反應(yīng)產(chǎn)香味的主要氨基酸。另外，美拉德產(chǎn)物中呈味氨基酸豐富，其中甘氨酸含量較多。

由表5 可知，當(dāng)以AAS 為標(biāo)準(zhǔn)時，鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物中色氨酸評分最高，其次為蛋氨酸+半胱氨酸；以RC 為標(biāo)準(zhǔn)時，氨基酸最小值為第一限制性氨基酸[25]，鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物的亮氨酸的RC 值最小，因此亮氨酸為第一限制性氨基酸。EAAI 是一項營養(yǎng)指標(biāo)，常用來評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值[26]，鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物的EAAI 為64．034，表明其營養(yǎng)價值豐富，是理想的調(diào)味基料，值得進一步研究開發(fā)利用。

3 討論

圖4 pH 值對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH value on Maillard Reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表3 鰹魚酶解液美拉德工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of Maillard reaction optimization for Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表4 氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition /(g·100g-1)

表5 鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物必需氨基酸營養(yǎng)評價Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids in Maillard reaction products of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

美拉德反應(yīng)是指羰基化合物的羰基和氨基化合物的氨基之間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)，因其反應(yīng)產(chǎn)物能對食品的風(fēng)味產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，已廣泛應(yīng)用于海鮮調(diào)味料的制備。李學(xué)鵬等[27]通過美拉德反應(yīng)改善四角蛤蜊酶解液風(fēng)味，所得產(chǎn)物具有濃郁的鮮香味。郭福軍等[28]研究了美拉德反應(yīng)對河蚌酶解液風(fēng)味的影響，結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)使河蚌肉酶解液肉香味濃郁。由于鰹魚蒸煮液本身腥味很重，加上酶解過程中脂質(zhì)的氧化降解以及蛋白質(zhì)降解，使得鰹魚酶解液的腥味也較重，影響食用。本研究結(jié)果表明，木糖-葡萄糖配比、溫度、反應(yīng)時間3 個因素對美拉德反應(yīng)影響較大，通過優(yōu)化美拉德反應(yīng)，可將鰹魚蒸煮液制成鮮味佳且含有豐富游離氨基酸的海鮮調(diào)味料。

采用PCA 和LDA 方法分析電子鼻數(shù)據(jù)能夠區(qū)分樣品間的差異性，已經(jīng)逐步應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域。李迎楠等[29]采用電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA 和LDA 檢測不同反應(yīng)溫度對牛肉風(fēng)味品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，不同溫度條件下肉味香精差異顯著。馮敏等[30]采用電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA 和LDA 檢測輻照肉鴨產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，結(jié)果表明，經(jīng)輻照處理后樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的響應(yīng)值均發(fā)生了變化。本研究在感官評價的基礎(chǔ)上，采用電子鼻技術(shù)結(jié)合LDA 能夠更有效地區(qū)分樣品間的差異性，并得出最優(yōu)美拉德反應(yīng)條件。后續(xù)研究將結(jié)合氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀(gas chromatographymass spectrometer， GC-MS)對其揮發(fā)性物質(zhì)進行深入研究。

美拉德反應(yīng)較為復(fù)雜，研究人員大多對此類美拉德反應(yīng)前后產(chǎn)物氨基酸成分進行研究，獲得少量特定的氨基酸與糖進行美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物的特征。氨基酸(尤其是游離氨基酸)對海鮮調(diào)味基料的呈味起著重要的作用。張慧芳等[31]在對魷魚內(nèi)臟水解液美拉德反應(yīng)前后氨基酸分析時發(fā)現(xiàn)，魷魚內(nèi)臟水解液美拉德反應(yīng)后產(chǎn)物組氨酸、脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸4 種氨基酸減少比例較明顯，是參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。童彥等[32]分析鳙魚蛋白水解液美拉德反應(yīng)前后氨基酸時發(fā)現(xiàn)，蛋白水解液美拉德產(chǎn)物中精氨酸、賴氨酸和酪氨酸減少較明顯，是參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。本研究發(fā)現(xiàn)，鰹魚酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后，其氨基酸含量有一定程度的下降，苯丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸和絲氨酸相對于其他氨基酸減少較明顯，說明這4 種氨基酸可能是參與該美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。其中反應(yīng)產(chǎn)物的必需氨基酸總含量較高，具有良好的營養(yǎng)性。另外，鰹魚酶解液美拉德產(chǎn)物的氨基酸組成豐富，共檢測出18 種氨基酸。其中，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸相對含量較高，谷氨酸和天冬氨酸為鮮味氨基酸，甘氨酸為甜味氨基酸，能使海鮮調(diào)味料香氣濃郁，這對利用鰹魚酶解液進行美拉德反應(yīng)制備海鮮調(diào)味料有重要的意義。

4 結(jié)論

本研究通過單因素試驗對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)影響因素進行研究，結(jié)果表明，木糖-葡萄糖配比、溫度及反應(yīng)時間對鰹魚酶解液美拉德反應(yīng)影響較大。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗得到鰹魚酶解液的最佳美拉德條件為木糖-葡萄糖配比1 ∶2、溫度110℃、反應(yīng)時間45 min，此時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值為0．630，感官評分為34．9 分。氨基酸組成成分分析發(fā)現(xiàn)，美拉德產(chǎn)物中共檢出18 種氨基酸，呈味氨基酸含量豐富。本研究為鰹魚酶解液的高值化利用提供了一種新的思路，對開發(fā)鰹魚風(fēng)味食品具有指導(dǎo)意義。