CO2和乙酸鈉對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)及其蝦青素積累的影響

葉 鑫 虞新磊 胡朝陽(yáng) 徐年軍 孫 雪

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院/浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315211)

強(qiáng)抗氧化劑蝦青素(3， 3′-二羥基-4， 4′-二酮基-β， β′-胡蘿卜素)主要存在于甲殼動(dòng)物、藻類(lèi)和微生物中，具有抵御紫外線(xiàn)傷害、提高免疫力、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[1]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是蝦青素的優(yōu)質(zhì)天然來(lái)源，其積累蝦青素量最高可達(dá)細(xì)胞干重的 4．6%[2]。雨生紅球藻是綠藻綱(Chlorophyceae)紅球藻科(Haematococcaceae)的一種單細(xì)胞微藻，在低光、營(yíng)養(yǎng)充足的環(huán)境中藻細(xì)胞呈綠色游動(dòng)狀態(tài)，生長(zhǎng)分裂迅速；在高光、高鹽、低氮等不利環(huán)境下藻細(xì)胞鞭毛消失、細(xì)胞壁增厚并靜止不動(dòng)開(kāi)始積累蝦青素[3-4]。因此，目前利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素一般分兩個(gè)階段：首先在適宜的培養(yǎng)條件下促進(jìn)綠色營(yíng)養(yǎng)階段藻的生物量積累，然后利用高光強(qiáng)等因素誘導(dǎo)厚壁孢子階段藻細(xì)胞的蝦青素積累。在這兩個(gè)階段碳源對(duì)藻的生長(zhǎng)和蝦青素積累都起著重要的作用。

CO2和碳酸氫鹽是雨生紅球藻培養(yǎng)中常用的無(wú)機(jī)碳源。與有機(jī)碳源相比，無(wú)機(jī)碳源可顯著降低培養(yǎng)基被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，適當(dāng)提高CO2濃度不僅可以促進(jìn)雨生紅球藻的生長(zhǎng)[5]，還可刺激藻細(xì)胞脂質(zhì)積累和蝦青素的合成[6-7]。與乙酸鹽相比較，碳酸氫鹽可誘導(dǎo)雨生紅球藻細(xì)胞產(chǎn)生更多的蝦青素，且持續(xù)補(bǔ)充5% CO2后雨生紅球藻蝦青素合成速率與含量更高，最大分別可達(dá)6．25 mg.L-1.d-1和175．7 mg.L-1[8]。除無(wú)機(jī)碳源外，雨生紅球藻也可以利用乙醇、乙酸鹽、甘油、葡萄糖等常見(jiàn)有機(jī)碳源進(jìn)行兼養(yǎng)生長(zhǎng)[9-12]。其中，乙酸鹽是雨生紅球藻培養(yǎng)中常用的廉價(jià)有機(jī)碳源。乙酸鹽可增強(qiáng)雨生紅球藻的呼吸作用，減少蝦青素積累時(shí)期高光脅迫對(duì)藻細(xì)胞的損傷，促進(jìn)藻的生長(zhǎng)和蝦青素的積累[13]，但乙酸鹽培養(yǎng)雨生紅球藻存在容易污染微生物、藻細(xì)胞活力低等問(wèn)題[14]。研究表明，在雨生紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充C5 有機(jī)碳可以極大地提高藻的生物量，改善藻細(xì)胞活力，且能減少污染[15]。

綜上，無(wú)機(jī)碳源和有機(jī)碳源在促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累方面發(fā)揮了重要的作用。本研究選用4 倍空氣CO2濃度(0．16% CO2)和響應(yīng)面法優(yōu)化所得的乙酸鈉濃度(0．023 mol.L-1)，比較了這2 種碳源對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)、蝦青素含量、酶活性和基因表達(dá)等參數(shù)的影響，以期為高效培養(yǎng)雨生紅球藻、提高蝦青素產(chǎn)量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與分組試驗(yàn)

雨生紅球藻藻株489，由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)提供，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NBM3#培養(yǎng)基[16]。綠色營(yíng)養(yǎng)階段培養(yǎng)條件：溫度為25±0．5℃，光通量為40 μmol.m-2.s-1，光暗周期比為12 h ∶12 h，初始接種密度約為4×104個(gè).mL-1。厚壁孢子培養(yǎng)：將生長(zhǎng)到平臺(tái)期的綠色營(yíng)養(yǎng)階段藻4 000 r.min-1離心5 min，收集藻細(xì)胞接入到等體積新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行高光脅迫(光通量150 μmol.m-2.s-1)以誘導(dǎo)蝦青素合成，培養(yǎng)溫度和光周期與綠色營(yíng)養(yǎng)階段相同。

試驗(yàn)共設(shè)置3 組處理：對(duì)照組(正常空氣，0．04%CO2)、高CO2組(0．16% CO2)、乙酸鈉組(正?？諝?0．023 mol.L-1乙酸鈉)。除碳源不同外，其他培養(yǎng)條件均相同。以上及后續(xù)試驗(yàn)每組均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察 分別在綠色營(yíng)養(yǎng)階段培養(yǎng)1、5、8 d 時(shí)和厚壁孢子階段培養(yǎng)1、3、5、8 d 時(shí)取3 mL 藻液4 000 r.min-1離心5 min，將藻體沉淀重懸于300 μL新鮮培養(yǎng)基中(后期藻液密度高時(shí)進(jìn)行稀釋)，制片后在CX21FS1 顯微鏡(OLYMPUS，日本)下放大400 倍觀(guān)察藻細(xì)胞形態(tài)和游動(dòng)性并拍照記錄。

1．2．2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 在綠色營(yíng)養(yǎng)階段培養(yǎng)過(guò)程中，每天定時(shí)取樣，使用UV-5200 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測(cè)定680 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值(OD680)，根據(jù)OD680(x)與細(xì)胞密度(y)關(guān)系曲線(xiàn)y＝8．326 2x+0．072 7(R2＝0．993 4)計(jì)算藻細(xì)胞密度。

1．2．3 干重測(cè)定 在兩個(gè)階段雨生紅球藻培養(yǎng)的第8 天，分別于6 500 r.min-1離心(4℃)10 min 收集藻體，將藻體沉淀冷凍干燥48 h 后準(zhǔn)確稱(chēng)重，然后將干藻粉保存在-80℃并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1．2．4 可溶性蛋白、總脂、總糖含量測(cè)定 分別稱(chēng)取培養(yǎng)第8 天兩個(gè)階段的干藻粉各0．1 g(干重，DW)，在液氮中充分研磨后，加入4 mL pH 值7．4 的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，渦旋混合均勻后于6 500 r.min-1(4℃) 離心10 min，保留上清液。利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量法測(cè)定可溶性蛋白含量[17]；利用香草醛法測(cè)定總脂含量[18]；使用總糖含量測(cè)試盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定總糖含量。

1．2．5 蝦青素含量測(cè)定 參考崔丹丹等[19]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取0．01 g 厚壁孢子階段(第8 天)的干藻粉，加入10 mL 5% KOH+30%甲醇，室溫靜置5 min；6 000 r.min-1離心(4℃)3 min 后取藻體沉淀研磨5 min，然后加入10 mL 二甲基亞砜在30℃水浴中抽提蝦青素。反復(fù)抽提至藻體變白后，用UV-5200 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD490。蝦青素含量計(jì)算公式為：

式中，C 為蝦青素含量，mg.g-1DW；OD490為樣品在490 nm 處的吸光度值；m 為樣品干重。

1．2．6 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析 在雨生紅球藻綠色營(yíng)養(yǎng)階段的第4 ～第6 天和厚壁孢子階段的第1 ～第3 天，每天分別離心收集藻體，使用Trizol 試劑(Invitrogen，美國(guó)) 提取藻的總RNA。分別使用iScript cDNA Synthesis kit 和iTaq Universal SYBR Green Supermix 試劑盒(Bio-Rad，美國(guó))進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[20]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR 引物采用Primer Premier 5．0 軟件設(shè)計(jì)，所用基因序列來(lái)自寧波大學(xué)藻類(lèi)生物資源利用團(tuán)隊(duì)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(表1)。

1．2．7 酶活力測(cè)定 取綠色營(yíng)養(yǎng)階段培養(yǎng)4、5、6 d和厚壁孢子階段培養(yǎng)1、2、3 d 時(shí)的藻液，6 500 r.min-1(4℃)離心10 min，每組取0．5 g 藻體(濕重，F(xiàn)W)，經(jīng)液氮研磨后，2 000 r.min-1(4℃)離心10 min，上清液即為粗酶液。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活力測(cè)定方法參考李合生[21]的分光光度法，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC) 和蘋(píng)果酸脫氫酶( malate dehydrogenase，MDH)活力測(cè)定均使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒。

表1 熒光定量PCR 的引物信息Table 1 Primer information for real-time quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD，n＝3)表示。數(shù)據(jù)分析和作圖使用Microsoft Office Excel 2017，并采用軟件SPSS 22．0 的單因素方差(one-way ANOVA)分析數(shù)據(jù)之間差異顯著性，P＜0．05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)的影響

在綠色營(yíng)養(yǎng)階段，不同碳源對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞狀態(tài)的影響較明顯(圖1)。培養(yǎng)前4 天時(shí)，3 組藻細(xì)胞都呈游動(dòng)狀態(tài)，細(xì)胞活力較好。對(duì)照組雨生紅球藻從培養(yǎng)第7 天開(kāi)始細(xì)胞活力減弱，少數(shù)藻的細(xì)胞壁開(kāi)始變厚；高CO2組在培養(yǎng)第8 天時(shí)雨生紅球藻細(xì)胞活力仍然較好，呈游動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)；乙酸鈉組在培養(yǎng)第5 天時(shí)大約有10%～20%的藻細(xì)胞壁增厚變成厚壁孢子，培養(yǎng)第8 天時(shí)約有70%～80%的細(xì)胞靜止不動(dòng)，約30%～40%藻細(xì)胞開(kāi)始積累蝦青素。

由圖2 可知，補(bǔ)充CO2和乙酸鈉對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯。培養(yǎng)1 d 時(shí)，藻細(xì)胞處于延滯期，細(xì)胞分裂緩慢；培養(yǎng)2 ～6 d 時(shí)，高CO2和乙酸鈉組藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度超過(guò)了對(duì)照組，但兩組之間無(wú)顯著差異；培養(yǎng)7～8 d 時(shí)，高CO2組藻細(xì)胞密度顯著高于乙酸鈉組。培養(yǎng)第8 天時(shí)，高CO2、乙酸鈉組藻細(xì)胞密度分別為對(duì)照組的2．55、2．23 倍(圖2)，干重分別為對(duì)照組的1．81、1．56 倍(表2)。綜上，提高CO2濃度或補(bǔ)充乙酸鈉都可顯著促進(jìn)雨生紅球藻的快速生長(zhǎng)，且在培養(yǎng)后期CO2的促進(jìn)作用大于乙酸鈉。

2.2 碳源對(duì)綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)的影響

雨生紅球藻的生理生化參數(shù)受CO2濃度和乙酸鈉的影響(表2)。高CO2組和乙酸鈉組藻的可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1．89 和1．23 倍(P＜0．05)；高CO2組和乙酸鈉組藻的總糖含量分別是對(duì) 照 組的0．77(P＜0．05)、1．09 倍(P＞0．05)；高CO2組和乙酸鈉組藻的總脂含量分別為對(duì)照組的0．65 和1．26 倍(P＜0．05)。以上結(jié)果表明，CO2促進(jìn)了綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻蛋白質(zhì)的合成，抑制了其碳水化合物和脂類(lèi)合成，而乙酸鈉則促進(jìn)了藻細(xì)胞蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的積累。

2.3 碳源對(duì)綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)及酶活力的影響

雨生紅球藻中Rubisco 大亞基、PEPC 和MDH 的編碼基因——rbcL、pepc2、mdh的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)外源添加碳源的響應(yīng)不同(圖3)。培養(yǎng)4 ～6 d，高CO2組中rbcL轉(zhuǎn)錄表達(dá)較穩(wěn)定且與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而乙酸鈉組藻rbcL 表達(dá)量在培養(yǎng)第5 和第6 d 時(shí)分別下降至對(duì)照組的57%和39%。在培養(yǎng)4～6 d 時(shí)，pepc2 和mdh表達(dá)量在2 種碳源添加組中均較對(duì)照組升高，但兩組間基本無(wú)顯著差異(pepc2 在培養(yǎng)第6 天時(shí)除外)。

CO2或乙酸鈉均顯著影響雨生紅球藻中Rubisco、PEPC 和MDH 活力(圖4)。培養(yǎng)過(guò)程中高CO2組藻細(xì)胞Rubisco 活力較為穩(wěn)定，且在培養(yǎng)第5 和第6 天時(shí)顯著高于其他兩組，表明適當(dāng)提高CO2濃度可以增強(qiáng)Rubisco 活力；乙酸鈉組中Rubisco 活力在培養(yǎng)前期與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在培養(yǎng)第6 天時(shí)較對(duì)照組顯著下降。PEPC 和MDH 對(duì)高CO2和乙酸鈉的響應(yīng)相似，培養(yǎng)4～6 d 時(shí)較對(duì)照組均升高，在第6 天時(shí)，高CO2和乙酸鈉組藻的PEPC 活力分別升高至對(duì)照組的1．98和1．45 倍，MDH 活力則分別升高至對(duì)照組的2．38 和2．01 倍。培養(yǎng)第6 天時(shí)，乙酸鈉組的2 種酶活力均低于高CO2組。以上結(jié)果表明，2 種碳源都可通過(guò)顯著提高PEPC、MDH 的活力來(lái)加速檸檬酸循環(huán)，為藻細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足能量。

2.4 碳源對(duì)厚壁孢子階段雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖5 可知，2 種碳源對(duì)厚壁孢子階段藻細(xì)胞的影響不同。對(duì)照組在高光脅迫第1 天，細(xì)胞活力降低并少量積累蝦青素，但大部分細(xì)胞仍呈游動(dòng)狀態(tài)；從脅迫第3 天開(kāi)始部分細(xì)胞轉(zhuǎn)為厚壁孢子，并有少量細(xì)胞溶解；脅迫第8 天時(shí)，大部分藻細(xì)胞積累蝦青素變紅，但仍有部分藻細(xì)胞為綠色。高CO2組中，高光脅迫第1 天，藻細(xì)胞活力好，游動(dòng)速度快；脅迫第3 天時(shí)，少量藻細(xì)胞開(kāi)始積累蝦青素；脅迫第5 天時(shí)大量細(xì)胞轉(zhuǎn)化為厚壁孢子同時(shí)細(xì)胞顏色變紅；脅迫第8 天時(shí)，藻細(xì)胞中已積累較多蝦青素，但藻細(xì)胞狀態(tài)較好，基本無(wú)細(xì)胞溶解。乙酸鈉組中，高光脅迫后蝦青素快速積累，在脅迫第1 天時(shí)90%以上的藻細(xì)胞已變成厚壁孢子；脅迫3～8 d 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)紅色區(qū)域不斷擴(kuò)大，表明蝦青素持續(xù)積累，但從脅迫第5 天開(kāi)始有少數(shù)藻細(xì)胞開(kāi)始溶解，且溶解細(xì)胞數(shù)隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增多。

圖2 綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 The growth curve of H. pluvialis at green vegetative stage

表2 綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)Table 2 Physiological and biochemical parameter of H. pluvialis at green vegetative stage

圖3 綠色營(yíng)養(yǎng)階段雨生紅球藻生長(zhǎng)相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 Expression levels of the growth-related enzymes of H. pluvialis at green vegetative stage

2.5 碳源對(duì)厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)的影響

在厚壁孢子階段，高CO2組和乙酸鈉組雨生紅球藻的生理生化參數(shù)與對(duì)照組差異顯著(除總脂含量外)(表3)。在脅迫第8 天時(shí)，3 個(gè)試驗(yàn)組藻細(xì)胞干重分別為0．24、0．47、0．37 g.L-1。以單位體積藻液來(lái)計(jì)算，高CO2組和乙酸鈉組中蝦青素含量分別為2．76和2．13 mg.L-1，分別是對(duì)照組的2．40 和1．85 倍?？梢?jiàn)補(bǔ)充CO2或乙酸鈉后藻細(xì)胞中蝦青素濃度顯著提高，且高CO2組大于乙酸鈉組。

厚壁孢子階段雨生紅球藻的可溶性蛋白含量由高到低表現(xiàn)為高CO2組＞乙酸鈉組＞對(duì)照組。兩個(gè)處理組中藻的總糖含量均顯著低于對(duì)照組，但兩組間無(wú)顯著差異；碳源種類(lèi)對(duì)厚壁孢子階段藻總脂含量無(wú)顯著影響。

2.6 碳源對(duì)厚壁孢子階段雨生紅球藻基因表達(dá)和酶活力的影響

在厚壁孢子階段雨生紅球藻中，蝦青素代謝相關(guān)酶八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)、β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase，CHY)和β-胡蘿卜素酮化酶(β-carotene ketolase，BKT)的編碼基因——pds、chy和bkt2 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)2 種碳源的響應(yīng)類(lèi)似(圖6)。在脅迫1 ～2 d 時(shí)，高濃度CO2總體抑制3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在脅迫第3天時(shí)，高CO2組中3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，與乙酸鈉組無(wú)顯著差異。與高CO2組不同，乙酸鈉組顯著促進(jìn)了3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)基因的表達(dá)。脅迫第1 天時(shí)，高CO2組pds、chy、bkt2 基因表達(dá)水平約為對(duì)照組的31%、41%和42%，而乙酸鈉組3 個(gè)基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的3．11、2．94 和4．18 倍。

圖5 厚壁孢子階段雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)Fig.5 Cell morphology of H. pluvialis at red cyst stage

在厚壁孢子階段，雨生紅球藻Rubisco 活力對(duì)CO2或乙酸鈉的響應(yīng)不同(圖7)。在對(duì)照組與高CO2組中，Rubisco 活力隨著高光脅迫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，而乙酸鈉組Rubisco 活力在脅迫1 ～3 d 內(nèi)無(wú)明顯變化。脅迫1～3 d 時(shí)，與對(duì)照組相比，高CO2組促進(jìn)了雨生紅球藻Rubisco 活力的升高，而乙酸鈉則主要抑制了Rubisco 活力。在高光脅迫第3 天時(shí)，高CO2組和乙酸鈉組Rubisco 活力分別為對(duì)照組的1．41 和0．50 倍(P＜0．05)。雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力在兩個(gè)處理組中的變化類(lèi)似，活力均較對(duì)照組提高。

表3 厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數(shù)和蝦青素含量Table 3 Physiological and biochemical parameter and astaxanthin content of H. pluvialis at red cyst stage

3 討論

3.1 CO2 和乙酸鈉對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響

CO2是藻類(lèi)生長(zhǎng)的重要碳源，因此在微藻培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)提高環(huán)境CO2濃度，可以促進(jìn)藻細(xì)胞的光合作用，加速藻類(lèi)生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，用15%CO2培養(yǎng)雨生紅球藻后，其光合作用、糖酵解、碳固定途徑等相關(guān)基因的表達(dá)均上調(diào)[22]。本研究結(jié)果顯示，CO2濃度從0．04%提高至0．16%后，藻生長(zhǎng)加快，其細(xì)胞密度和干重都增加，這可能與藻的光合作用、能量代謝增強(qiáng)有關(guān)。同時(shí)，較高的CO2濃度可以延緩藻細(xì)胞衰老，提高細(xì)胞的活力，因此在培養(yǎng)第8 天時(shí)藻細(xì)胞活力仍較好，細(xì)胞壁也未變厚。

乙酸鹽是微藻培養(yǎng)中常用的有機(jī)碳源，可以使藻進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)。乙酸鹽進(jìn)入藻細(xì)胞后在乙酰CoA 合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)的催化作用下直接生成乙酰CoA，后者又可以參與到檸檬酸循環(huán)和脂質(zhì)合成等代謝過(guò)程中。乙酸鈉可以促進(jìn)聚球藻(Synechococcus leopoliensis)生長(zhǎng)，其主要原因是由于乙酸鈉增加了檸檬酸循環(huán)中的碳代謝流量[23]。本研究添加乙酸鈉后雨生紅球藻生長(zhǎng)加快，但在培養(yǎng)后期，藻的生長(zhǎng)速度和生物量均低于高CO2組，這可能與后期乙酸鈉組游動(dòng)藻細(xì)胞數(shù)量減少，部分藻細(xì)胞壁逐漸變厚并開(kāi)始積累蝦青素有關(guān)。Pang 等[15]發(fā)現(xiàn)添加乙酸鈉會(huì)導(dǎo)致雨生紅球藻游動(dòng)性變差，培養(yǎng)至第7 天時(shí)游動(dòng)細(xì)胞數(shù)量只占總細(xì)胞數(shù)的7%，本研究結(jié)果與之相似。

圖7 厚壁孢子階段雨生紅球藻生長(zhǎng)相關(guān)酶活力Fig.7 Activities of growth-related enzymes of H. pluvialis at red cyst stage

Rubisco 作為光合作用的關(guān)鍵酶之一，在植物細(xì)胞中主要起固定CO2的作用。加富1 000 ～1 500 μmol.L-1CO2可提高Rubisco 和Rubisco 活化酶的活力，從而提高黃瓜葉片凈光合速率[24]。CO2濃度升高可促進(jìn)擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)光捕獲效率和光合作用能量轉(zhuǎn)換效率，使Rubisco 活力增強(qiáng)[25]。本研究中高濃度CO2促進(jìn)了雨生紅球藻Rubisco 活力升高，提高了細(xì)胞固碳和光合效率，從而加速了藻的生長(zhǎng)。乙酸鈉會(huì)抑制雨生紅球藻Rubisco活力和Rubisco 編碼基因的表達(dá)[26]，本研究中乙酸鈉組藻細(xì)胞Rubisco 活力及rbcL表達(dá)水平在培養(yǎng)后期均下降，該結(jié)果與以上報(bào)道一致。PEPC、MDH 在植物細(xì)胞內(nèi)均可以催化草酰乙酸的生成，而草酰乙酸是檸檬酸循環(huán)中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。本研究中，CO2或乙酸鈉均提高了雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力及其相關(guān)編碼基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，CO2比乙酸鈉提高效果更明顯?？梢?jiàn)， CO2濃度升高可以促進(jìn)雨生紅球藻Rubisco、PEPC 和MDH 活力增強(qiáng)，加快光合作用和檸檬酸循環(huán)，從而促進(jìn)藻生物量的積累；而乙酸鈉則主要通過(guò)加速檸檬酸循環(huán)為細(xì)胞代謝提供更多能量，從而促進(jìn)藻的生長(zhǎng)。

無(wú)論在高光還是低光培養(yǎng)條件下，2 種碳源處理組雨生紅球藻Rubisco 活力變化趨勢(shì)基本一致，即高CO2濃度增強(qiáng)Rubisco 活力，乙酸鈉則抑制其活力。曾曉鵬等[27]發(fā)現(xiàn)160 μmol.m-2.s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下，高CO2濃度可顯著增強(qiáng)三角褐指藻Rubisco 活力，使得藻細(xì)胞的凈光合效率得到提高。Zhang 等[13]發(fā)現(xiàn)添加乙酸鈉后，雨生紅球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合速率下降，光合作用減弱，該結(jié)果與本研究中乙酸鈉對(duì)Rubisco 活力的影響類(lèi)似。在綠色營(yíng)養(yǎng)和厚壁孢子階段，雨生紅球藻中PEPC 和MDH 活力均受高濃度CO2或乙酸鈉的誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)程度不同。

3.2 CO2 和乙酸鈉對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響

本研究中，乙酸鈉的添加對(duì)雨生紅球藻蝦青素合成有較大的影響。在綠色營(yíng)養(yǎng)階段后期，乙酸鈉組中約30%～40%的雨生紅球藻細(xì)胞開(kāi)始合成蝦青素；高光脅迫開(kāi)始后藻細(xì)胞中蝦青素合成更加快速，在脅迫第1 天藻細(xì)胞即快速變紅。在高光脅迫條件下，乙酸鈉促進(jìn)雨生紅球藻合成蝦青素可能與乙酸鈉可增強(qiáng)細(xì)胞呼吸速率，為蝦青素合成提供充足碳骨架、提高藻細(xì)胞自身光保護(hù)作用有關(guān)[13]。

PDS、CHY、BKT 是參與蝦青素合成的關(guān)鍵酶。本研究高CO2組中，這3 種酶的編碼基因表達(dá)量在脅迫1～2 d 時(shí)降低或無(wú)明顯差異，在脅迫第3 天時(shí)上升；而乙酸鈉組中，3 個(gè)相關(guān)基因在脅迫第1 天就開(kāi)始快速大量表達(dá)，說(shuō)明乙酸鈉促進(jìn)蝦青素積累的速度比高CO2要快，而且這3 個(gè)蝦青素代謝相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平變化與高CO2組藻細(xì)胞變紅速度慢于乙酸鈉組的現(xiàn)象一致。Cheng 等[9]利用2%～10%CO2誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素，0 ～5 d 時(shí)所有試驗(yàn)組蝦青素積累量均較低，而從第5 天開(kāi)始蝦青素快速合成，這一現(xiàn)象與本研究類(lèi)似。另外，Gao 等[28]研究表明，乙酸鈉在第0．5或第2 天能快速促進(jìn)雨生紅球藻蝦青素合成相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)，如八氫番茄紅素合酶基因(phytoene synthase，psy)、番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lycopene beta cyclase，lyc)以及bkt基因。

4 結(jié)論

在綠色營(yíng)養(yǎng)階段，2 種碳源均可以加快藻的生長(zhǎng)、可溶性蛋白的合成，增強(qiáng)PEPC、MDH 活力及其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在厚壁孢子階段，2 種碳源均可以提高藻的生物量、蝦青素產(chǎn)量、3 個(gè)蝦青素合成相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平以及PEPC 和MDH 活力。綜上，適當(dāng)補(bǔ)充CO2或乙酸鈉均可促進(jìn)雨生紅球藻生物量和蝦青素的積累，但高CO2濃度培養(yǎng)的藻細(xì)胞狀態(tài)好，乙酸鈉則在促進(jìn)蝦青素的快速積累方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。本研究在一定程度上闡明了這2 種碳源促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累的機(jī)理，為開(kāi)展雨生紅球藻蝦青素的高效生產(chǎn)提供了參考。