異源表達(dá)EgrNAC1提高擬南芥抗寒性和對(duì)干旱、高鹽的敏感性

從 青 倪曉祥 程龍軍

(浙江農(nóng)林大學(xué)/亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

植物在生長發(fā)育過程中，極易遭受干旱、鹽堿、極端溫度等非生物逆境脅迫的影響。同時(shí)，在長期進(jìn)化中，植物自身也形成了一套應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的機(jī)制，在逆境脅迫產(chǎn)生時(shí)，使其能夠迅速感受到逆境信號(hào)，進(jìn)而從分子、細(xì)胞、生理和發(fā)育水平上提高植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力和抗性[1-2]。分子水平上，轉(zhuǎn)錄因子作為控制基因時(shí)空表達(dá)的開關(guān)，在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要功能[3-4]。參與植物非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子種類眾多，包括NAC、bZIP、WRKY、MYB、DREB、ERF等[5]。其中，NAC(NAM、ATAF1/2 和CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的大型轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC 轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物生長和發(fā)育[6]，而且在抵抗低溫、干旱、高鹽、病原菌等多種生物和非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[7]。

最早在矮牽牛(Petumnia hybrida)中發(fā)現(xiàn)NAC基因，該基因缺失影響根尖分生組織和葉片發(fā)育[8]。NAC基因還被證明參與植物側(cè)根發(fā)育[9-10]、頂端分生組織分化[11]、次生細(xì)胞壁形成[12]、器官衰老[13]和花發(fā)育[14]等過程。近年研究表明，NAC與非生物脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。參與非生物逆境響應(yīng)的NAC基因統(tǒng)稱為SNAC(stress-relatedNAC)[15]，如水稻(Oryza stativa)SNAC1 基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在田間遭受嚴(yán)重干旱情況下，結(jié)實(shí)率仍比對(duì)照組高22%～34%，其營養(yǎng)生長階段的抗寒性與耐鹽性也顯著提高[16]。鷹嘴豆(Cicer arietinumL．)CarNAC6 在擬南芥(Arabidopsis thliana)中超表達(dá)也能提高轉(zhuǎn)基因株系的抗旱和耐鹽性[17]。同一植物中不同NAC 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮的功能不同，胡楊(Populus euphratica)中的PeNAC036 在擬南芥中超表達(dá)能顯著提高轉(zhuǎn)基因株系對(duì)干旱和高鹽的抗性；而PeNAC034 的超表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系卻提高了對(duì)干旱和高鹽脅迫的敏感性；楊樹中超表達(dá)另一個(gè)NAC 基因PeNAC045，則會(huì)使植株在鹽和干旱脅迫下降低氣孔導(dǎo)度、呼吸速率和凈光合速率[18]。由于在逆境響應(yīng)中NAC 發(fā)揮的功能多樣且復(fù)雜，因此有必要對(duì)在非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要功能的NAC 基因進(jìn)行深入研究。

桉樹(Eucalyptus)作為我國南方栽培的重要用材樹種，低溫、干旱等逆境一直是影響其栽培效益和限制其栽培范圍的主要原因。浙江農(nóng)林大學(xué)桉樹抗逆分子育種課題組前期在巨桉中發(fā)現(xiàn)一個(gè)參與非生物逆境響應(yīng)的NAC基因EgrNAC1(Eucgr.I00058)，其在低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)，都有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)，同時(shí)還參與脫落酸(abscisic acid，ABA)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測(cè)其可能在桉樹非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要功能[19]。本研究利用異源轉(zhuǎn)化手段，在擬南芥中超表達(dá)EgrNAC1，初步分析轉(zhuǎn)基因株系在低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫下的響應(yīng)，以期為深入研究該基因在非生物逆境響應(yīng)中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Col)。EgrNAC1 基因來自于浙江農(nóng)林大學(xué)保存的巨桉G5 無性系材料。擬南芥生長環(huán)境條件為25℃/15 h(光)、22℃/9 h(暗)，相對(duì)濕度65%，光照強(qiáng)度為100 μmol.m-2.s-1。

1.2 EgrNAC1 超表達(dá)載體構(gòu)建、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

超表達(dá)載體構(gòu)建采用Gateway 技術(shù)，載體選用pGWB 系列含35S 啟動(dòng)子的pGWB402Ω。以巨桉葉片中提取的mRNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)EgrNAC1 mRNA 序列設(shè)計(jì)Gateway 載體引物(表1)。以逆轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用BP ClonaseTMEnzyme Mix(賽默飛，美國)將擴(kuò)增產(chǎn)物與入門載體pDONR221 進(jìn)行重組反應(yīng)。獲得的陽性克隆測(cè)序正確后，再用LR ClonaseTMEnzyme Mix(賽默飛，美國)進(jìn)行Gateway 重組反應(yīng)。重組的陽性克隆提取質(zhì)粒后，利用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 中，利用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。侵染植株種子在含60 mg.L-1卡那霉素(Kanamycin)的1/2 MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，獲得的陽性株系通過分子檢測(cè)后，繼續(xù)進(jìn)行繁殖，篩選，直至獲得T3 轉(zhuǎn)基因純合株系。

1.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中EgrNAC1 的表達(dá)

將獲得的3 個(gè)超表達(dá)EgrNAC1 擬南芥T3 轉(zhuǎn)基因純合株系和Col 于基質(zhì)中培養(yǎng)10 d，剪取完全展開的蓮座葉片，利用RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)提取RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物(表1)，以AtACTIN為內(nèi)參，進(jìn)行半定量PCR 試驗(yàn)。同時(shí)，用Bio-Rad CFX96(Bio-Rad， 美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quanitative real-time PCR， RT-qPCR)試驗(yàn)，用系統(tǒng)自帶的Bio-Rad CFX Manager(Ver 1．5．5．34)軟件進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，分析轉(zhuǎn)基因純合株系中EgrNAC1 的表達(dá)情況。

1.4 低溫、干旱和高鹽處理試驗(yàn)

將EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 純合轉(zhuǎn)基因株系與Col 種子均勻撒播至濕潤的育苗基質(zhì)中，4℃處理2 d，轉(zhuǎn)移至擬南芥生長室培養(yǎng)。子葉展開后，移栽至含相等重量基質(zhì)的育苗盆中培養(yǎng)2 周，進(jìn)行低溫、干旱和高鹽處理試驗(yàn)。野生型和不同轉(zhuǎn)基因株系各處理3盆，每盆9 株苗，重復(fù)3 次。

低溫處理：將長勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)移至Snijders 微氣候控制生長箱(MC1000，荷蘭)，參考Steponkus等[20]和閻依超等[21]的方法，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。將幼苗放置于-6℃處理12 h 后，再于4℃處理1 d，然后轉(zhuǎn)移至生長室恢復(fù)5、9 d 后，拍照并統(tǒng)計(jì)存活率。

干旱處理：選取長勢(shì)一致的幼苗，對(duì)育苗盆稱重，用水調(diào)整各育苗盆使其重量一致，停止?jié)菜?，至植株葉片完全萎蔫后再恢復(fù)澆水3 d，拍照并統(tǒng)計(jì)存活率。

高鹽處理：參考Liu 等[22]的方法，選取長勢(shì)一致的幼苗，澆灌NaCl 溶液(300 mmol.L-1)，每盆每天澆灌100 mL，每天1 次，處理至產(chǎn)生鹽漬化并呈現(xiàn)差異(約2 周左右)后，拍照。

1.5 離體葉片失水率測(cè)定

選取長勢(shì)一致的2 周苗齡幼苗，于稱量紙上快速剪取第3 ～第6 片蓮座葉，每20 片為一個(gè)樣本，稱重(m0)，設(shè)置3 次重復(fù)，每隔1 h 稱重1 次(m1)。按照公式計(jì)算失水率：

1.6 低溫響應(yīng)相關(guān)基因的定量表達(dá)分析

將14 d 苗齡的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理(方法見1．4)，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，參考劉靜妍等[23]的方法設(shè)計(jì)擬南芥低溫響應(yīng)相關(guān)基因AtCBF1、AtCBF2 及AtRD29A等定量引物，進(jìn)行RT-qPCR，試劑由大連TaKaRa 公司提供，定量引物由南京金斯瑞生物工程技術(shù)有限公司合成，具體序列如表1 所示。

表1 引物列表Table 1 The list of primers used

1.7 ABA 處理方法

取Col 和EgrNAC1 超表達(dá)株系EgrNAC1-OE1，EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8 純合株系的種子，用75%乙醇消毒10 min，均勻點(diǎn)播在含0．5 μmol.L-1ABA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上，同時(shí)點(diǎn)播在未添加ABA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上(對(duì)照)，均在4℃冰箱中放置48 h，然后正常培養(yǎng)10 d 后，觀察ABA 對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的影響。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

RT-qPCR 結(jié)果利用2-ΔΔCt法[24]計(jì)算獲得。采用GraphPad Prism (ver 5．01)軟件作圖并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超表達(dá) EgrNAC1 擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中EgrNAC1 的表達(dá)

將構(gòu)建好的載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥植株后，篩選陽性株系并繁育至T3，獲得3 個(gè)純合體株系：EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8，并對(duì)這3 個(gè)株系進(jìn)行EgrNAC1 表達(dá)情況分析(圖1-A)。結(jié)果表明，3個(gè)株系中EgrNAC1 都有較高豐度的表達(dá)。定量表達(dá)結(jié)果(圖1-B)進(jìn)一步表明，EgrNAC1 在EgrNAC1-OE8株系中的表達(dá)量最高，EgrNAC1-OE1 次之，EgrNAC1-OE6 最低。

2.2 超表達(dá)EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫處理下的表型分析

為了解EgrNAC1 在非生物逆境響應(yīng)中的功能，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系中EgrNAC1 表達(dá)量高的2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 進(jìn)行-6℃低溫處理。正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因株系EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 生長2 周的植株與同苗齡野生型植株長勢(shì)一致。-6℃處理12 h 后，轉(zhuǎn)基因株系與野生型都產(chǎn)生不同程度凍害，然后，再于正常生長條件下恢復(fù)生長到第5天，轉(zhuǎn)基因株系的生長恢復(fù)情況明顯好于野生型，恢復(fù)9 d 后，轉(zhuǎn)基因株系幾乎完全恢復(fù)生長(圖2-A)，EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE8 的存活率分別達(dá)到了88．9%和81．5%，而野生型只有29．6%(圖2-B)。由此可見，EgrNAC1 的表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力。

圖1 擬南芥野生型和EgrNAC1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中EgrNAC1 的半定量(A)和定量(B)表達(dá)Fig.1 Semi-quantitative (A) and quantitative (B)expression analysis of EgrNAC1 in wide type and EgrNAC1 overexpression transgenic lines

2.3 超表達(dá)EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫處理下抗寒相關(guān)基因的表達(dá)分析

參與植物低溫響應(yīng)的分子調(diào)控途徑主要為CBF(CRT/DRE-binding factor)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的植物低溫響應(yīng)途徑[25]。針對(duì)ICE(inducer of CBF expression)-CBF 途徑中的重要基因AtICE1、AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、AtRD29A、AtCOR15、AtCOR47 等，分析了低溫處理下轉(zhuǎn)基因株系中上述基因的表達(dá)。由圖3 可知，4℃低溫處理下，2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中AtCBF1、AtCBF2 和AtRD29A的表達(dá)量顯著上調(diào)，而其他基因無顯著變化。暗示轉(zhuǎn)基因株系抗寒能力的提高可能是通過EgrNAC1促進(jìn)AtCBF1、AtCBF2 和AtRD29A的表達(dá)引起的。

2.4 超表達(dá)EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱、高鹽處理下的表型分析

圖2 野生型和EgrNAC1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系-6℃低溫處理后恢復(fù)5 d 和9 d 的表型(A)與存活率(B)Fig.2 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines after 12 h treatment of -6℃and recover for 5 and 9 days under normal temperature (A). And, survival ratio of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under low temperature treatment(B)

由圖4-A 可知，干旱處理后，恢復(fù)供水3 d，野生型擬南芥葉片從失水萎蔫狀態(tài)中逐漸恢復(fù)，而轉(zhuǎn)基因株系EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 則無法恢復(fù)，存活率為0，而野生型存活率為100%， 表明超表達(dá)EgrNAC1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)干旱的敏感程度提高。進(jìn)一步對(duì)離體葉片的失水率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系離體葉片失水率均高于野生型(圖4-B)，表明干旱條件下轉(zhuǎn)基因株系對(duì)干旱敏感性的提高可能與葉片過快的失水反應(yīng)有一定的關(guān)系。

圖3 4℃低溫處理12 h 野生型和EgrNAC1 超表達(dá)株系中AtICE1,AtCBF1,AtCBF2,AtCBF3,AtRD29A,AtCOR15 和AtCOR47 的表達(dá)分析Fig.3 Analysis of gene expression of AtCBF1,AtCBF2 and AtRD29A under 4℃treatment for 12 hours in wide type and EgrNAC1 overexpression lines

高鹽(300 mmol.L-1NaCl)處理2 周后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)葉片黃化、焦枯等鹽漬化傷害表型。但EgrNAC1-OE1 和EgrNAC1-OE8 的鹽害更為嚴(yán)重，葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，植株生長受到更加明顯的抑制作用，表明EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)鹽的敏感度也高于野生型(圖5)。

圖4 野生型和EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因株系干旱處理下的表型(A)與葉片離體失水率比較(B)Fig.4 Phenotype(A) and water loss ratio(B) of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under drought treatment

圖5 野生型和EgrNAC1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系高鹽處理表型Fig.5 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines under salt treatment

2.5 超表達(dá)EgrNAC1 轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA 處理下的表型分析

ABA 影響植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)[26]。為了進(jìn)一步分析逆境響應(yīng)中影響EgrNAC1 發(fā)揮功能的因素，對(duì)EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8 進(jìn)行ABA 處理。由圖6 可知，與野生型相比，EgrNAC1超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系葉柄更長，展開葉更大，根系更壯，說明EgrNAC1-OE1、EgrNAC1-OE6 和EgrNAC1-OE8對(duì)ABA 的敏感程度大幅度降低，EgrNAC1 的表達(dá)影響了植株對(duì)ABA 的反應(yīng)，進(jìn)而可能會(huì)影響植株對(duì)ABA依賴性非生物逆境信號(hào)的響應(yīng)。

3 討論

圖6 野生型和EgrNAC1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)BA 處理10 d 后的表型Fig.6 Phenotype of wide type and EgrNAC1 overexpression lines treated with ABA after 10 days

NAC 是參與非生物逆境響應(yīng)的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物抵抗低溫、干旱和高鹽等非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。植物NAC 類轉(zhuǎn)錄因子中，大約有20%～25%的成員參與了至少1 種以上的非生物逆境響應(yīng)，而且這些NAC 類轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化上親緣關(guān)系很近，大都屬于同一個(gè)進(jìn)化分支，統(tǒng)稱其為SNAC(stress-responsive NAC)[15]。EgrNAC1 也 屬 于SNAC類轉(zhuǎn)錄因子，為SNAC-A 亞類[19]。該亞類中的成員廣泛參與植物的低溫、干旱、高鹽和氧化脅迫等逆境響應(yīng)[15]。擬南芥中的ANAC019、ANAC055、ANAC072 和ATAF1 都屬于該類成員，均受干旱和高鹽的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[27-28]。同時(shí)，超表達(dá)ANAC019、ANAC055 和ANAC072 的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系還顯著增強(qiáng)了對(duì)干旱的耐受性[29]。而ATAF1 被認(rèn)為是非生物逆境響應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，突變體ataf1 對(duì)干旱的耐受性強(qiáng)于野生型，同時(shí)，超表達(dá)ATAF1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)ABA、高鹽和氧化逆境的敏感性也增強(qiáng)[27]。水稻中屬于SNAC-A 亞類的SNAC1、SNAC2 和OsNAC3 ～5 也都被高鹽、干旱、低溫和ABA 誘導(dǎo)，水稻中超表達(dá)SNAC1能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱的抵抗能力，同時(shí)增加植株對(duì)ABA 的敏感性[30]。這表明SNAC-A 類的NAC 類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物的非生物逆境響應(yīng)過程。而EgrNAC1 同樣表現(xiàn)出明顯的非生物逆境響應(yīng)，其在低溫、干旱、高鹽和ABA 處理后的表達(dá)都表現(xiàn)出明顯誘導(dǎo)效應(yīng)[19]。

本研究在EgrNAC1 表達(dá)分析基礎(chǔ)上，通過超表達(dá)載體構(gòu)建和擬南芥的異源轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步分析了EgrNAC1 在非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮的功能，結(jié)果表明，超表達(dá)EgrNAC1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系，對(duì)ABA的敏感性降低，對(duì)高鹽和干旱處理的敏感程度增強(qiáng)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)低溫的抵抗能力卻大幅度增強(qiáng)。-6℃凍害處理12 h 后的存活率，相當(dāng)于對(duì)照的29．6%，轉(zhuǎn)基因株系存活率達(dá)到80% 以上，表明EgrNAC1 對(duì)不同的非生物逆境產(chǎn)生的響應(yīng)不同。很多植物中的NAC 類轉(zhuǎn)錄因子也有類似的現(xiàn)象，如南荻(Miscanthus lutarioriparius)MlNAC5 基因的超表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)NaCl 的敏感性，但同時(shí)增強(qiáng)了植株的抗寒與抗旱能力[31]。GmNAC2 在煙草中超表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、高鹽和低溫的敏感性都增強(qiáng)，但抵抗氧化逆境的能力得到大幅度提高[32]。水稻OsNAC095 在干旱和低溫逆境中發(fā)揮的功能也表現(xiàn)出雙面性，抑制OsNAC095 的表達(dá)能夠提高水稻植株的抗旱性能，卻降低了其對(duì)低溫的耐受能力[33]。這反應(yīng)了NAC 類轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物逆境響應(yīng)中功能的復(fù)雜性。EgrNAC1 可能也具有這種特點(diǎn)，對(duì)干旱、高鹽和低溫有不同的響應(yīng)。

在非生物脅迫條件下，EgrNAC1 與很多植物中的NAC 類基因也有不同的表現(xiàn)。如水稻中超表達(dá)SNAC1 提高對(duì)ABA 的敏感性，在干旱信號(hào)產(chǎn)生時(shí)迅速關(guān)閉氣孔，降低了組織內(nèi)部水分損失，進(jìn)而提高植株的抗旱性[30，34]。小麥(Triticum aestivum)TaNAC29 也有類似特征[35]。但檸條(Caragana intermedia)CiNAC3和CiNAC4 基因超表達(dá)株系卻降低了對(duì)ABA 的敏感性，其耐鹽性提高[28]。EgrNAC1 超表達(dá)擬南芥植株對(duì)ABA 敏感性降低，同時(shí)對(duì)干旱、高鹽的敏感性增強(qiáng)。超表達(dá)EgrNAC1 擬南芥植株抗旱能力減弱可能是由于其對(duì)ABA 敏感性降低，導(dǎo)致干旱時(shí)植株葉片不能及時(shí)接收ABA 信號(hào)，氣孔關(guān)閉延遲而導(dǎo)致植株抵抗干旱的能力下降，這也與葉片離體試驗(yàn)結(jié)果吻合。

ICE-CBF 途徑是植物響應(yīng)低溫逆境，調(diào)控低溫脅迫適應(yīng)性的重要分子途徑[36-37]。研究表明，NAC 類轉(zhuǎn)錄因子也通過參與該條途徑調(diào)控植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。香蕉(Musa acuminata)中的MaNAC1 是MaICE1的直接調(diào)控蛋白，同時(shí)還與MaCBF1 互作影響香蕉植株對(duì)低溫的響應(yīng)[38]。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中MfNAC3 則可直接結(jié)合在MfNAC3 的啟動(dòng)子上，作為一個(gè)正向調(diào)控因子調(diào)控植株的低溫逆境響應(yīng)[39]。大豆GmNAC20 還可以直接結(jié)合在低溫響應(yīng)下游基因RD29A的啟動(dòng)子上發(fā)揮作用[10]。本試驗(yàn)對(duì)低溫處理下EgrNAC1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中ICE-CBF 途徑及低溫響應(yīng)的部分下游基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中2 個(gè)CBF基因AtCBF1 和AtCBF2，以及AtRD29A的表達(dá)量相對(duì)于野生型都有顯著升高，表明超表達(dá)株系低溫抗性提高很可能與EgrNAC1 對(duì)ICE-CBF 途徑基因的調(diào)控有關(guān)。

由于NAC 類轉(zhuǎn)錄因子處于多個(gè)非生物逆境信號(hào)交叉互作的位置，NAC 接受到不同的逆境信號(hào)后，會(huì)通過與其他響應(yīng)蛋白的互作調(diào)控不同的下游基因，產(chǎn)生不同響應(yīng)，從而導(dǎo)致NAC 基因功能的復(fù)雜性。EgrNAC1 可能也具有這種特性。因此，進(jìn)一步研究EgrNAC1 在桉樹中參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與低溫、干旱和高鹽逆境信號(hào)之間的交叉互作和調(diào)控機(jī)制，對(duì)了解其在桉樹抗逆中的地位及應(yīng)用具有重要意義。

4 結(jié)論

巨桉中受低溫、干旱、高鹽和ABA 誘導(dǎo)表達(dá)的EgrNAC1，其超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)ABA 的敏感性下降。轉(zhuǎn)基因植株抗寒性顯著增強(qiáng)，但提高了對(duì)干旱和高鹽的敏感性?；虮磉_(dá)結(jié)果表明，EgrNAC1 參與低溫抗性增強(qiáng)效應(yīng)可能與EgrNAC1 對(duì)ICE-CBF 途徑基因的調(diào)控有關(guān)。因此，EgrNAC1 可能參與了巨桉低溫、干旱和高鹽等非生物逆境的響應(yīng)過程。這些結(jié)果有利于進(jìn)一步研究和明確EgrNAC1 在桉樹中的功能和調(diào)控機(jī)制，為桉樹抗逆分子輔助育種工作提供了理論依據(jù)。