iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示西瓜響應(yīng)CGMMV脅迫的蛋白質(zhì)

張慧青 孫玉燕 那冬晨 范 敏

(1山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)屬于蕪菁花葉病毒科煙草花葉病毒屬。自1935年在英國(guó)首次被報(bào)道以來(lái)[1]，已有30 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)在葫蘆科作物生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)CGMMV，對(duì)葫蘆科作物的品質(zhì)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重威脅[2-7]。西瓜感染CGMMV 后，葉片出現(xiàn)濃綠色凹凸斑，莖部出現(xiàn)褐色病斑，果實(shí)發(fā)生畸形，果肉出現(xiàn)空洞、腐爛且呈暗紅色[8]。近年來(lái)，CGMMV 傳播速度迅速加快，對(duì)葫蘆科作物尤其是西瓜產(chǎn)業(yè)的商業(yè)育種、育苗培育、種子貿(mào)易、產(chǎn)品生產(chǎn)和零售等帶來(lái)全球性危害[8]。因此，研究西瓜對(duì)CGMMV 的響應(yīng)，將為闡明其分子機(jī)理及后續(xù)提高西瓜對(duì)CGMMV 的抗性奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于西瓜感染CGMMV 轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究已取得一定進(jìn)展[9-13]。通過(guò)對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)胞壁成分和光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes， DEGs)可能參與CGMMV 病害癥狀的產(chǎn)生[9]。對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定到1 641 個(gè)DEGs，這些DEGs 主要參與光合作用、植物-病原菌互作、次生代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝途徑[10]。對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜葉片進(jìn)行DNA 甲基化分析，發(fā)現(xiàn)RdDM(RNA-directed DNA methylation)介導(dǎo)的CHH 甲基化水平降低在西瓜抗病毒防御中發(fā)揮重要作用[11]。通過(guò)對(duì)感染CGMMV 前后的西瓜葉片進(jìn)行小RNA(micro RNAs，miRNAs)測(cè)序，獲得多個(gè)參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的miRNAs，包括miR164、 miR319 和miR393[12]。對(duì)西瓜葉片中CGMMV衍生的短干涉RNA(short intering RNAs，siRNAs)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些siRNAs 的長(zhǎng)度多為21 或22 nt，主要來(lái)源于病毒正義鏈，siRNAs 作用的宿主轉(zhuǎn)錄本包括MYB、WD40、bHLH、真核翻譯起始因子、細(xì)胞色素P450 和纖維素合酶等，表明siRNAs 在病毒-宿主相互作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。在蛋白質(zhì)水平上研究西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答，可進(jìn)一步挖掘CGMMV 脅迫應(yīng)答的蛋白質(zhì)并明確其蛋白互作網(wǎng)路。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究植物-病毒相互作用和病毒侵染過(guò)程中蛋白質(zhì)功能特征的有力工具，它可以提供比基因組研究更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。近年來(lái)，利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)研究病毒誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變化在植株中已有報(bào)道[14-16]。對(duì)煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)侵染的煙草進(jìn)行iTRAQ 蛋白質(zhì)組分析，表明煙草中保持D1 蛋白的穩(wěn)定性和能量的合理利用對(duì)抵抗TMV 的侵染至關(guān)重要[14]。對(duì)煙草葉片進(jìn)行iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)分析，表明RNA 誘導(dǎo)的DNA 甲基化在防御雙生病毒衛(wèi)星DNAgeminivirus-betasatellite 感染中發(fā)揮重要作用[15]。利用iTRAQ 技術(shù)結(jié)合液相二級(jí)質(zhì)譜 ( liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)，在黃瓜葉片中鑒定到38 個(gè)參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的差異表達(dá)蛋白，其中23 個(gè)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，15 個(gè)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)[16]。對(duì)CGMMV 接種前后的西瓜果實(shí)進(jìn)行iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定到595 個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括404 個(gè)上調(diào)蛋白和191 個(gè)下調(diào)蛋白，其中與葉綠素代謝、丙酮酸代謝、TCA 循環(huán)、熱休克蛋白、硫氧還蛋白、核糖體蛋白、翻譯起始因子和延伸因子相關(guān)蛋白的積累水平受到CGMMV 侵染的強(qiáng)烈影響；功能注釋表明這些差異表達(dá)蛋白主要參與光合作用、碳水化合物代謝、次生代謝物質(zhì)合成、植物與病原體互作、蛋白質(zhì)合成與轉(zhuǎn)化等[17]。本研究以iTRAQ 技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)，對(duì)CGMMV 侵染前后的西瓜葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以期揭示參與西瓜葉片響應(yīng)CGMMV 脅迫的蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 前處理試驗(yàn)

將易感CGMMV 的西瓜自交系材料JJZ-M(保存于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所西瓜研究室)種植于溫度25℃，光照/黑暗(16 h/8 h)，濕度60%的光照培養(yǎng)箱中，待兩片真葉期進(jìn)行接種。取人工接種CGMMV 的發(fā)病本氏煙草葉片和10 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH 值7．2)按1 ∶5(w/v)的比例混合研磨成糊狀病毒汁液。

試驗(yàn)組：取兩片真葉期的植株，在葉面散上金剛砂，蘸取制作好的少量病毒汁液輕輕搓揉葉片2 ～3次，用清水沖去多余的金剛砂；對(duì)照組(CK，即0 h)：植株只接種10 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液。分別于接種后0 h、48 h 和25 d 取樣，3 個(gè)取樣階段的葉片癥狀見(jiàn)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所西瓜組早期的報(bào)道[11]。與接種0 h 的植株相比，接種CGMMV 25 d 的葉片癥狀明顯，包括葉片形成綠色凹凸病斑及葉脈萎縮，而接種48 h 的植株無(wú)明顯病癥[11]。每個(gè)處理設(shè)置2 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于iTRAQ 測(cè)序及分析。

1.2 蛋白質(zhì)提取、定量、酶解和肽段標(biāo)記

將接種CGMMV 0 h、48 h 和25 d 的西瓜葉片加入5 倍體積的放射免疫沉淀裂解液，超聲破碎處理5 min，于4℃、10 000×g條件下離心10 min；取上層清液，配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。

每個(gè)處理樣品中吸取100 μg 蛋白質(zhì)于EP 管，并用 100 mmol.L-1三乙胺- 碳酸緩沖溶液(triethylammonium bicarbonate，TEAB，pH 值8．5)將體積調(diào)整為100 μL；隨后加入5 μL 200 mmol.L-1三羧基乙基膦溶液[Tris(2-carboxyethyl) phosphine buffer，TCEP，pH 值8．5]，將樣品置于55℃條件下孵育1 h；取5 μL 375 mmol.L-1碘乙酰胺溶液(使用前，將9 mg碘乙酸酰胺溶于132 μL 100 mmol.L-1TEAB 溶液中，配制成375 mmol.L-1碘乙酸酰胺)加入樣品中，室溫下避光孵育30 min；在樣品中加入600 μL 預(yù)冷丙酮，于-20℃放置不少于4 h；之后，于4℃、8 000×g條件下離心10 min，保留白色沉淀，室溫干燥2 ～3 min；取100 μL 50 mmol.L-1TEAB 溶液重溶蛋白質(zhì)沉淀，添加2．5 μg 胰蛋白酶后在37℃下酶切蛋白過(guò)夜。

肽鏈利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag，TMT)試劑標(biāo)記，標(biāo)記在室溫下進(jìn)行1 h。標(biāo)記的肽在分餾前使用TMTsixples 等壓質(zhì)量標(biāo)記試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)進(jìn)行操作和干燥。

1.3 肽分離與LC-MS/MS 分析

利用 Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)分餾已標(biāo)記的肽，孵育后的樣品溶于300 μL 0．1% 三氯乙酸溶液中。在樣品中加入300 μL 的5% 乙腈-0．1% 三乙胺去除未反應(yīng)的TMT 溶液，然后加入300 μL 洗脫液，3 000×g離心2 min，收集片段。真空離心法將每個(gè)離心管中的液體蒸發(fā)至干，分離的肽在含有0．1%甲酸和2%乙腈的緩沖液中溶解。12 000×g、4℃離心10 min 后，轉(zhuǎn)移到LC-MS 樣品瓶中。片段在Easy-nLC 1000(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)上運(yùn)行，該nLC 1000與Orbitrap Q ExactiveTMHF 質(zhì)譜儀耦合(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.4 蛋白質(zhì)鑒定和定量

通過(guò)Proteome Discoverer 2．0 將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為MGF 文件。利用MASCOT v2．3(英國(guó)Matrix 科學(xué) 公司) 將數(shù)據(jù)比對(duì)到西瓜UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：/ /www．uniprot．org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定及定量。母離子容差設(shè)置為10-5，MS/MS 碎片離子的質(zhì)量容差設(shè)置為0．6 Da，胰蛋白酶消化過(guò)程中允許兩次缺失裂解。將甲硫氨酸氧化作為可變修飾，將半胱氨酸氨基甲?；鳛楣潭ㄐ揎?。選擇單一同位素質(zhì)量，只有在95%置信水平下具有顯著得分的多肽是可信的，并用于蛋白質(zhì)鑒定。

1.5 差異表達(dá)蛋白鑒定及KEGG 功能分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白(differentially expressed proteins，DEPs)進(jìn)行篩選鑒定，將FC≥1．2(或≤1/1．2)和P＜0．05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。FC≥1．2 的蛋白認(rèn)為是上調(diào)，F(xiàn)C≤1/1．2 的蛋白認(rèn)為是下調(diào)。P值由t檢驗(yàn)計(jì)算得出。對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基于KEGG Pathway 的功能富集分析。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

在基于BLAST 算法的搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(用于檢索基因/蛋白質(zhì)相互作用的搜索工具)中，DEPs 用作原始序列以揭示蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。STRING 是收錄多個(gè)物種預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證的PPI 的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括直接的物理互作和間接功能相關(guān)。每個(gè)相互作用都有一個(gè)綜合得分，代表蛋白質(zhì)之間相互作用的可信度，綜合得分(0：最低置信度；1：最高置信度)大于0．4 的PPI 做進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)分析，并用Cytoscape 將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖視化。

1.7 RT-qPCR 驗(yàn)證蛋白質(zhì)在CGMMV 脅迫下的表達(dá)

與蛋白質(zhì)組測(cè)序的取樣時(shí)間一致，分別在接種CGMMV 后0 h、48 h 和25 d 采集西瓜葉片，提取總RNA。用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)將總RNA(2 μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)使用TransStart Top Green qPCR Supermix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，在StepOne Plus Real-Time PCR System(美國(guó)ABI 公司)中完成。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸10 s；40 次循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)門(mén)ubulin，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[18]。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。用于RT-qPCR分析的引物見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 分析所用的引物Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 基于iTRAQ 分析的蛋白質(zhì)鑒定

iTRAQ 分析共產(chǎn)生396 個(gè)多肽，只有不到4．3%的肽段具有≥20 個(gè)氨基酸殘基，92．4%的肽段具有7～16個(gè)氨基酸殘基(圖1)。通過(guò)比對(duì)UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定獲得88 個(gè)蛋白質(zhì)(表2)。通過(guò)對(duì)每個(gè)處理2 個(gè)重復(fù)間蛋白質(zhì)表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)(r2)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)r2大于0．99，證實(shí)了測(cè)序結(jié)果的可靠性(圖2)。

表2 利用iTRAQ 在3 個(gè)文庫(kù)中鑒定到的蛋白質(zhì)Table 2 Proteins identified using iTRAQ in three libraries

表2(續(xù))

表2(續(xù))

圖1 西瓜CGMMV 侵染前后的多肽長(zhǎng)度分布Fig.1 Distribution of peptide lengths in watermelon before and post CGMMV infection

2.2 參與西瓜對(duì)CGMMV 脅迫應(yīng)答的DEPs

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的FC≥1．2 且P＜0．05 時(shí)，認(rèn)為其表達(dá)上調(diào)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的FC≤1/1．2 且P＜0．05 時(shí)，認(rèn)為其表達(dá)下調(diào)。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，鑒定到61 個(gè)DEPs(表3、圖3)。與接種0 h 相比，15 個(gè)蛋白質(zhì)在接種后48 h 呈現(xiàn)差異表達(dá)(均為下調(diào)表達(dá))，37 個(gè)蛋白質(zhì)在接種后25 d 呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)(24 個(gè)上調(diào)，13 個(gè)下調(diào))；與接種后48 h 相比，51 個(gè)蛋白質(zhì)在接種后25 d 呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)(45 個(gè)上調(diào)，6 個(gè)下調(diào))。這些DEPs 包括熱激蛋白和生物防御素類(lèi)蛋白、光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ蛋白、ATP 合成酶、ATP 合酶、NADH 脫氫酶、真核翻譯起始因子、核糖體蛋白、乙烯受體、乙烯響應(yīng)因子、蔗糖合成酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶。例如，核糖體蛋白L22(A0A1P8LDU4)、光系統(tǒng)Ⅰ鐵硫中心(A0A1P8LDV7)和光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白H(A0A1P8LEZ9) 在48 h_0 h、 25 d_0 h 和25 d_48 h 表達(dá)下調(diào)，而核糖體蛋白S4(D5I3A5)、NADH 脫氫酶亞基9(D5I3C1)、HSP22．8(H6TB36)、真核細(xì)胞翻譯起始因子6(Q6I663)、蔗糖合酶( Q9SBL8) 和乙烯受體(V9QGW9)在25 d_0 h 和25 d_48 h 表達(dá)上調(diào)。

2.3 CGMMV 脅迫應(yīng)答DEPs 的KEGG 功能分析

通過(guò)對(duì)DEPs 進(jìn)行KEGG 富集分析鑒定參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的代謝途徑。由圖4 可知，48 h_0 h的DEPs 主要參與光合作用、核糖體、α-亞麻酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、氧化磷酸化、光合生物中的碳固定、碳代謝作用、代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑。而25 d_0 h 和25 d_48 h 的DEPs 主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、類(lèi)胡蘿卜素生物合成、糖酵解/糖異生、嘌呤代謝、嘧啶代謝、RNA 聚合酶、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)和真核生物核糖體生物合成、光合生物中的碳固定、淀粉和蔗糖代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑。

表3 在3 個(gè)文庫(kù)中鑒定的差異表達(dá)蛋白Table 3 DEPs identified among three libraries

表3(續(xù))

2.4 西瓜響應(yīng)CGMMV 脅迫的DEPs 的PPI 分析

在基于BLAST 算法的搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(用于檢索基因/蛋白質(zhì)相互作用的搜索工具)，DEPs 被用作原始序列，并使用綜合評(píng)分大于0．4 的PPIs 來(lái)確定互作網(wǎng)絡(luò)。48 h_0 h 的13 個(gè)DEPs 在CGMMV 脅迫下參與已知的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分別是PSAA(A0A1P8LDG4)、NDHI(A0A1P8LDL8)、RPL22(A0A1P8LDU4)、PSAC( A0A1P8LDV7 )、 RPS11 ( A0A1P8LEJ1 )、 rps2(A0A1P8LEM9)、RPS7．2(A0A1P8LEV5)、AtCg00380( A0A1P8LEX7 )、 PSBH ( A0A1P8LEZ9 )、 YCF3( A0A1P8LF51 )、 PSBE ( A0A1P8LF81 )、 RBCL(A5X4H2)和LHCB6(D1MWY9)(圖5-A)。

25 d_0 h 的32 個(gè)DEPs 在CGMMV 脅迫下參與已知的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分別是RPOB(A0A1P8LF53)、RPL22(A0A1P8LDU4)、PSBH(A0A1P8LEZ9)、NAD7( D5I3D0 )、PETD ( A0A1P8LF98 )、 YCF3( A0A1P8LF51 )、 RBCL ( A5X4H2 )、 RPOC2( A0A1P8LDN2 )、 PSAC ( A0A1P8LDV7 )、 ABA1(F8QV17)、PSBE(A0A1P8LF81)及NAD9(D5I3C1)等(圖5-B)。

圖3 3 個(gè)文庫(kù)中DEPs 的聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of DEPs identified from three libraries

25 d_48 h 的43 個(gè)DEPs 在CGMMV 脅迫下參與已知的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分別是RPL2．2(A0A1P8LDK7)、 RPS12A ( A0A1P8LF74)、 RPL22( A0A1P8LDU4 )、 NAD7 ( D5I3D0 )、 RPS11( A0A1P8LEJ1 )、 PSAC ( A0A1P8LDV7 )、 PSBB( A0A1P8LDA4 )、 RPOB ( A0A1P8LF53 )、 rps2(A0A1P8LEM9)、AtCg00380(A0A1P8LEX7)及PSBH(A0A1P8LEZ9)等(圖5-C)。

這些 DEPs 中， PSAC (A0A1P8LDV7)、 RPL22(A0A1P8LDU4)和PSBH(A0A1P8LEZ9)共同參與了上述互作網(wǎng)絡(luò)，表明它們?cè)谖鞴螩GMMV 脅迫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。

2.5 RT-qPCR 驗(yàn)證DEPs 的基因表達(dá)

選取SUS4(Q9SBL8)、RPL22(A0A1P8LDU4)、NAD7(D5I3D0)、PSBH(A0A1P8LEZ9)、Defensin-like protein 5 ( V5LFZ0)、 ATPF ( A0A1P8LD68)、 LSP1(C7SG38) 和HSP22．8(H6TB36) 蛋白質(zhì)進(jìn)行RTqPCR 驗(yàn)證(圖6)。SUS4 ( Q9SBL8 )、RPL22(A0A1P8LDU4)、ATPF( A0A1P8LD68) 和PSBH(A0A1P8LEZ9)在接種后48 h 和25 d 呈逐漸下調(diào)表達(dá)。HSP22．8(H6TB36)在接種后48 h 和25 d 呈逐漸上調(diào)表達(dá)。NAD7(D5I3D0)在接種后48 h 的表達(dá)下調(diào)，而后在接種后25 d 維持與接種后48 h 相似的表達(dá)水平。Defensin-like protein 5(V5LFZ0)在接種后48 h 的表達(dá)上調(diào)，而在接種后25 d 的表達(dá)顯著下調(diào)。LSP1(C7SG38)在接種0 h 和接種后48 h 維持穩(wěn)定的表達(dá)水平，而在接種后25 d 的表達(dá)水平顯著上調(diào)。

圖4 DEPs 的KEGG 功能富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of DEPs

3 討論

mRNA、miRNAs 和siRNAs 等諸多因子參與西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答[9-13]。為了在蛋白質(zhì)水平上鑒定參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的蛋白質(zhì)，本研究利用iTRAQ 結(jié)合LC-MS/MS 技術(shù)共獲得61 個(gè)DEPs。與黃瓜響應(yīng)CGMMV 脅迫的DEPs 相比，本研究中的部分DEPs，如細(xì)胞色素b6、核糖體蛋白、肌動(dòng)蛋白及NADP(H)氧化還原酶等，參與西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答。

圖5 西瓜響應(yīng)CGMMV 的DEPs 的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Protein-protein interaction analysis of DEPs in response to CGMMV stress in watermelon

3.1 CGMMV 脅迫影響西瓜諸多生理生化過(guò)程

受病毒感染的植物通常表現(xiàn)為光合速率降低，這表明光合作用是宿主抗病毒防御應(yīng)答中被抑制的主要生命活動(dòng)[19]。本研究中，7 個(gè)光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ蛋白( A0A1P8LDA4、 A0A1P8LDG4、 A0A1P8LDM9、A0A1P8LDV7、 A0A1P8LEY8、 A0A1P8LEZ9 和A0A1P8LF51)被鑒定為DEPs，這與之前的報(bào)道一致。例如，轉(zhuǎn)基因番茄中與光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ相關(guān)的蛋白質(zhì)在CMV 的脅迫應(yīng)答中呈現(xiàn)差異表達(dá)[20]。其中，光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白H(A0A1P8LEZ9)是光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心核心的重要組成部分，可將光能轉(zhuǎn)換為電化學(xué)能[21]，其在CGMMV 感染后48 h 和25 d 呈下調(diào)表達(dá)。此外，光系統(tǒng)Ⅱ47 kDa 蛋白和光系統(tǒng)ⅡD1 蛋白在接種CGMMV 后25 d 呈上調(diào)表達(dá)，表明維持正常光合作用對(duì)西瓜抵御CGMMV 的侵染至關(guān)重要。

能量代謝受植物-病毒相互作用的影響。本研究中，3 個(gè)ATP 合酶 亞基(A0A1P8LD68、D5I3A7 和D5I3B4) 和2 個(gè)NADH 脫氫酶亞基(D5I3C1 和D5I3D0)參與西瓜對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答，其中ATP酶(D5I3A7 和D5I3B4)和NADH 脫氫酶(D5I3C1 和D5I3D0)的表達(dá)上調(diào)。擬南芥ATP 酶CRT1 可與多種抗性蛋白相互作用，調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)蕪菁皺縮病毒的抗病性[22]。水稻OsAAA-APTase1 在SA 介導(dǎo)的對(duì)稻瘟病菌(Magnapor the oryzae)的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)OsAAA-ATPase1 可顯著提高致病相關(guān)基因的表達(dá)和對(duì)M. oryzae的抗性；反之，RNAi 沉默該基因抑制水稻對(duì)M. oryzae的抗性[23]。

核糖體蛋白質(zhì)參與rRNA 結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生及蛋白質(zhì)合成機(jī)制的運(yùn)作，同時(shí)也可保護(hù)植物免受病原菌的侵害[24-25]。核糖體蛋白編碼基因RPL12 和RPL19 在本氏煙草中被沉默后，非寄主細(xì)菌誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)延遲；擬南芥AtRPL12 和AtRPL19 突變體的非寄主抗性也降低，說(shuō)明RPL12 和RPL19 通過(guò)同一途徑獲得非寄主抗性[24]。棉花中GaRPL18的表達(dá)受到黃萎病菌(Verticillium dahliae)侵染的誘導(dǎo)，GaRPL18 的表達(dá)模式與不同品種的抗病性水平一致；GaRPL18 基因沉默使抗性材料中免疫相關(guān)因子的豐度降低，抗性材料變?yōu)橐赘胁牧?；GaRPL18 過(guò)表達(dá)擬南芥對(duì)黃萎病的抗性明顯提高[25]。本研究中，9個(gè)核糖體蛋白( A0A1P8LDK7、A0A1P8LDU4、A0A1P8LEJ1、A0A1P8LEJ2、A0A1P8LEM9、A0A1P8LEV3、A0A1P8LEV5、A0A1P8LEX7 和D5I3A5) 在CGMMV侵染后呈現(xiàn)差異表達(dá)，表明這些核糖體蛋白在CGMMV 脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

乙烯作為重要的信號(hào)可調(diào)控植物對(duì)一系列生物和非生物脅迫的應(yīng)答。研究報(bào)道煙草中EREBP/AP2 過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)多個(gè)致病相關(guān)基因的表達(dá)，提高煙草對(duì)病原體及鹽脅迫的耐受性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)了2 種參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異表達(dá)蛋白，分別是乙烯受體(V9QGW9)和乙烯響應(yīng)因子(X2KY76)。其中，乙烯受體在25 d_0 h 和25 d_48 h 呈上調(diào)表達(dá)，乙烯響應(yīng)因子在25 d_48 h 呈上調(diào)表達(dá)，表明誘導(dǎo)的乙烯信號(hào)蛋白與CGMMV 的防御應(yīng)答有關(guān)。

3.2 CGMMV 脅迫下的重要蛋白質(zhì)及調(diào)控機(jī)理

植物病毒可以在感染周期通過(guò)宿主植物的翻譯因子來(lái)翻譯其自身的病毒RNA，翻譯起始因子在植物-病毒相互作用中賦予植物抵抗病毒感染的能力[27-29]。與0 h 和48 h 相比，本研究中的2 個(gè)真核翻譯起始因子：eIF (iso) 4E (C7SG38) 和eIF6A (Q6I663)， 在CGMMV 侵染后25 d 呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，參與對(duì)CGMMV 的脅迫應(yīng)答。植物eIF4E 家族成員是眾所周知的宿主因子，在多種病毒感染中起關(guān)鍵作用[27-29]。植物eIF4E 的主要作用是通過(guò)結(jié)合5′cap [m7G(5′)ppp(5′)N]和其他翻譯因子，進(jìn)而控制蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的表達(dá)[30]。大白菜eIF(iso)4E 基因(retr02)的剪接變異體在第1 個(gè)外顯子處產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子，產(chǎn)生一個(gè)截短、無(wú)功能的蛋白質(zhì)，蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus，TuMV)可以在2 個(gè)位點(diǎn)上使用eIF(iso)4E 的拷貝，使大白菜產(chǎn)生持久的TuMV 抗性[31]。TuMV 感染植物時(shí)，需要病毒末端結(jié)合蛋白(viral protein genome-linked，VPg)與宿主eIF4E 或eIF(iso)4E 相互作用才能啟動(dòng)翻譯[32]。擬南芥eIF(iso)4E 突變導(dǎo)致對(duì)TEV、TuMV 產(chǎn)生廣譜抗性[33]。此外，TuMV VPg 僅與擬南芥eIF(iso)4E 基因(AT5G35620)相互作用，而不與擬南芥的其他eIF4E 發(fā)生互作[34]。eIF6 是60S 核糖體核仁生物合成所必需的蛋白[35]，但目前鮮有報(bào)道表明其參與植物對(duì)病毒的脅迫應(yīng)答。本研究中，eIF6A 與RAN3、LSP1、RPL23．2、RPS15A 等蛋白互作，參與CGMMV 的脅迫應(yīng)答。

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)被認(rèn)為具有分子伴侶的功能，在植物中普遍存在，當(dāng)機(jī)體受到不同脅迫時(shí)，HSPs 可以保護(hù)其靶蛋白不變性，不發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集[36-37]。sHSPs 作為HSPs 的重要成員，其分子量為15 ～42 kDa，在應(yīng)答植物生物脅迫中發(fā)揮重要作用[38]。本研究中sHSPs 成員HSP22．8(H6TB36)的表達(dá)在CGMMV 接種后25 d 顯著上調(diào)。水稻HSP20 的表達(dá)受水稻條紋病毒(RSV)感染的影響，此外，發(fā)現(xiàn)HSP20 與RSV 蛋白(RdRp) 和運(yùn)動(dòng)蛋白(NSVc4)相互作用，在RSV 復(fù)制和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[39-40]。CGMMV 侵染西瓜后，sHSP 的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步通過(guò)酵母雙雜、GSP pull-down 及免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，CGMMV 解旋酶(helicase HEL)可與西瓜sHSP互作，說(shuō)明sHSP 可能調(diào)節(jié)宿主防御機(jī)制以應(yīng)對(duì)CGMMV 的侵染[41]。

3.3 CGMMV 脅迫下的蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組比較分析

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所西瓜組前期對(duì)CGMMV 侵染前后(0 h 及24 h)的西瓜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得1 641 個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，包括886 個(gè)上調(diào)和755 個(gè)下調(diào)DEGs[10]。本研究共鑒定到61 個(gè)DEPs。與DEPs 相似，KEGG 功能分析顯示這些DEGs 同樣參與光合作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生物質(zhì)代謝等KEGG 代謝途徑[10]。通過(guò)DEGs 與DEPs 的比較分析，發(fā)現(xiàn)葉綠素a/b 結(jié)合蛋白、NADH 脫氫酶、核糖體蛋白、光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ相關(guān)蛋白、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合成酶、HSP22 等在蛋白水平和基因水平上均呈現(xiàn)差異表達(dá)。如葉綠素a/b 結(jié)合蛋白(D1MWY9)在CGMMV 侵染后48 h 和25 d 均呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)；葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白基因(Cla004746、 Cla018117、Cla022573、 Cla019105、 Cla017325、Cla022963、Cla011748、 Cla012368、 Cla019595、 Cla013826 及Cla011145)在CGMMV 侵染后24 h 均呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)。與蛋白表達(dá)水平一致，核糖體蛋白、NADH 脫氫酶及光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ相關(guān)蛋白的編碼基因在CGMMV 侵染后24 h 呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)。β - 葡萄糖苷酶(G9BSA4)及蔗糖合成酶(Q9SBL8)在CGMMV 侵染后25 d 呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，而β-葡萄糖苷酶基因(Cla004804) 及蔗糖合成酶基因(Cla017392、Cla011131 及Cla009124)在CGMMV 侵染后24 h 即呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明，參與西瓜光合作用的蛋白和基因在CGMMV 脅迫早期即表現(xiàn)出響應(yīng)；而參與次生物質(zhì)代謝的蛋白對(duì)CGMMV 脅迫應(yīng)答的響應(yīng)較基因要延遲一些。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)iTRAQ 技術(shù)鑒定到61 個(gè)參與CGMMV 脅迫應(yīng)答的蛋白質(zhì)，這些DEPs 參與光合作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生物質(zhì)代謝等KEGG 代謝途徑。此外，本研究還明確了這些蛋白質(zhì)之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上明確了西瓜響應(yīng)CGMMV 的脅迫應(yīng)答，為后續(xù)提高西瓜對(duì)CGMMV 的抗性及闡明其分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。