不同材料壓舌板體外細胞毒性效應(yīng)研究

羅 吉，陳小青，李 冰，馬中春

(寧波海關(guān)技術(shù)中心，浙江 寧波 315100)

壓舌板是一種常規(guī)的醫(yī)用診療檢查器具，已廣泛應(yīng)用于口腔及咽喉部常規(guī)檢查及窒息搶救等專業(yè)領(lǐng)域。尤其是近年來，隨著霧霾、呼吸道疾病增多，壓舌板在呼吸道疾病檢查中的應(yīng)用也更為廣泛。壓舌板早期以鐵質(zhì)為主，雖也有不銹鋼材質(zhì)的，但如今以木制和竹制為最常見、常用，因為木制和竹制壓舌板體現(xiàn)了一次性使用的衛(wèi)生要求。但是，有關(guān)壓舌板的毒理學(xué)安全性評價研究，尤其是體外細胞毒性效應(yīng)研究卻未見公開報道。筆者選用了分化能力較強，對生長環(huán)境要求較低，比較容易進行人工培養(yǎng)的L929細胞作為試驗細胞，對3種材料的壓舌板體外細胞毒性效應(yīng)進行了評價，旨在為醫(yī)療器械檢測提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為醫(yī)療器械生物學(xué)毒性評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

L929細胞株(小鼠成纖維細胞株)，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液于37℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

胎牛血清，購于德國PAN公司；青鏈霉素混合液和0.25%胰蛋白酶，購于HyClone公司；MEM培養(yǎng)液，購于CORNING公司；異丙醇，購于上海國藥；噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，購于索萊寶公司。

1.1.4 受試物

木制壓舌板，規(guī)格為150 mm×16mm，竹制壓舌板，規(guī)格為150 mm×16 mm，不銹鋼壓舌板，規(guī)格為160 mm×19 mm，均購自當?shù)厥袌觥?h3>1.2 方法

1.2.1 對照組設(shè)置

以含10%胎牛血清培養(yǎng)液為空白對照，含10%胎牛血清培養(yǎng)液浸提高密度聚乙烯所得浸提液為陰性對照，64 mg/mL苯酚溶液為陽性對照。

1.2.2 浸提液的制備

以含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，受試物表面積與培養(yǎng)基體積比為3cm：1 mL，在37℃下恒溫振蕩24 h。所得液體作為100%浸提原液，并稀釋得到75%、50%、25%的浸提液。

1.2.3 染毒處理

L929細胞用0.25%胰酶(含EDTA)消化細胞制備成單細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，然后將細胞重新分散于培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為1×10個/mL，接種上述細胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中(CO體積分數(shù)5%，濕度＞90%)培養(yǎng)24 h；待細胞長成單層后，吸出原來的培養(yǎng)液，分別加入100 μL不同濃度(25%、50%、75%、100%)的受試物浸提液、空白對照、陽性對照和陰性對照，37℃，CO體積分數(shù)5%條件下培養(yǎng)24 h。每組做5個平行樣。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)24 h后，取出96孔板在顯微鏡下觀察細胞的圓縮、貼壁、溶解等狀態(tài)。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率

觀察后，吸出原來的培養(yǎng)液，每孔加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄去MTT溶液，每孔加入100 μL異丙醇溶液。振蕩平板，在570 nm處測量

D

(570)值(參照波長650 nm)，按下式計算細胞相對存活率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26進行分析，各組間吸光度值比較采用單因素方差分析和

t

檢驗LSD法。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

空白對照組和陰性對照組細胞內(nèi)顆粒明顯，細胞無溶解，生長狀態(tài)良好(圖1A)；陽性對照組幾乎所有細胞壞死(圖1B)；100%木制壓舌板浸提液組幾乎所有細胞壞死(圖1C)；75%浸提液組也是幾乎所有細胞全部壞死；50%浸提液組圓縮、疏松貼壁及無胞內(nèi)顆粒的細胞比例位于50%～70%；25%浸提液組圓縮、疏松貼壁及無胞內(nèi)顆粒的細胞比例位于20%～50%。竹制壓舌板各濃度組胞內(nèi)顆粒明顯，細胞無溶解，生長狀態(tài)良好(圖1D)。100%不銹鋼壓舌板浸提液組圓縮、疏松貼壁及無胞內(nèi)顆粒的細胞比例小于20%(圖1E)；其他各濃度組胞內(nèi)顆粒明顯，細胞無溶解，生長狀態(tài)良好。根據(jù)GB/T 16886.5-2017中浸提液細胞毒性形態(tài)學(xué)定性評價標準，木制壓舌板細胞毒性為4級，反應(yīng)程度重度，有細胞毒性作用；竹制壓舌板細胞毒性為0級，無細胞毒性作用；不銹鋼壓舌板細胞毒性為1級，反應(yīng)程度輕微，無細胞毒性作用。

2.2 MTT實驗檢測結(jié)果

經(jīng)MTT法所測陽性對照組和各劑量受試物浸提液組

D

(570)值均明顯小于陰性對照組(見表1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。計算得出100%木制壓舌板浸提液的細胞相對存活率為20.1%，100%竹制壓舌板浸提液的細胞相對存活率為89.1%；100%不銹鋼壓舌板浸提液的細胞相對存活率為81.2%。GB/T 16886.5-2017中提及，存活率較低時，試驗樣品潛在的細胞毒性較高，如存活率下降到小于空白的70%，則具有潛在的細胞毒性。木制壓舌板的細胞存活率小于空白對照的70%，表明該受試物具有潛在的細胞毒性，竹制壓舌板和不銹鋼壓舌板的細胞存活率大于空白對照的70%，表明這兩種受試物不具有潛在的細胞毒性。

圖1 各組細胞的形態(tài)學(xué)觀察

表1 不同濃度的3種壓舌板浸提液染毒后L929細胞相對存活率(MTT法)

3 討論

醫(yī)療器械行業(yè)是知識密集、多學(xué)科交叉、競爭挑戰(zhàn)激烈的高科技產(chǎn)業(yè)，是國家制造業(yè)和高科技尖端水平的標志之一。醫(yī)療器械是與人們生活密切、生命安全息息相關(guān)的特殊產(chǎn)品，壓舌板則是其中廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)產(chǎn)品。但是，有關(guān)壓舌板的毒理學(xué)安全性評價研究尤其是體外細胞毒性效應(yīng)卻鮮有公開報道。筆者對3種材料的壓舌板體外細胞毒性效應(yīng)進行了評價，旨在為醫(yī)療器械檢測提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為醫(yī)療器械生物學(xué)毒性評估提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，100%木制壓舌板浸提液組幾乎所有細胞全部壞死，100%竹制壓舌板浸提液組胞內(nèi)顆粒明顯，細胞無溶解，生長狀態(tài)良好。100%不銹鋼壓舌板浸提液組圓縮、疏松貼壁及無胞內(nèi)顆粒的細胞比例小于20%。經(jīng)MTT法所測

D

(570)值計算得出100%木制壓舌板浸提液的細胞存活率為20.1%；100%竹制壓舌板浸提液的細胞存活率為89.1%；100%不銹鋼壓舌板浸提液的細胞存活率為81.2%。根據(jù)細胞毒性判定標準，木制壓舌板對L929細胞有潛在細胞毒性，竹制壓舌板和不銹鋼壓舌板無細胞毒性作用。考慮到壓舌板制作過程中所使用的加工材料和原材料本身都可能會對細胞毒性的判定有影響。提示，不同材料的壓舌板在細胞毒性上存在差異性，部分材料的壓舌板具有細胞毒性或潛在細胞毒性，綜合評價壓舌板毒性應(yīng)繼續(xù)進行更為全面的毒理學(xué)研究。