漆姑草醇提物對(duì)白血病細(xì)胞K562的誘導(dǎo)分化作用

伏 瓊，唐文娟，程 勇，賀仁政，梁 冰，2，

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng)550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

白血病全世界每年新發(fā)病例約30萬(wàn)，死亡率高達(dá)70%，在我國(guó)死亡率是3.86/10萬(wàn)，其中兒童所占比率日益增加，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。白血病是多因素、多基因，多分子機(jī)制參與的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其進(jìn)展快，常規(guī)治療手段有聯(lián)合化療、基因治療、免疫治療等，預(yù)后差。誘導(dǎo)分化治療白血病不直接殺傷白血病細(xì)胞，而是誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化為正常細(xì)胞或接近正常細(xì)胞，逐漸成為白血病治療的主要治療策略之一。大量天然藥物及其成分對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用的研究，讓從中草藥中開(kāi)發(fā)高效低毒的分化誘導(dǎo)劑成為白血病治療的熱點(diǎn)。漆姑草味苦，性涼，生于陰濕處，為石竹科植物漆姑草的全草，民間治療白血病效果明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)漆姑草醇提物(

Herba Saginae Japonicae

，HSJ)對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞(K562)的作用，探討HSJ對(duì)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制，擬為漆姑草對(duì)白血病的治療作用闡明理論依據(jù)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

TS-100-F倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；Elx 800UV酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；BD FACSCantoⅡ Flow Cytometer 338960流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dikson公司)；凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

漆姑草全草，購(gòu)于貴陽(yáng)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德教授鑒定；臺(tái)盼藍(lán)、四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、1640 培養(yǎng)基及雙抗(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美國(guó)Merck公司)；硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium bluechloride， NBT， 美 國(guó) Sigma-Aldrich公司)；佛波酯(phorbol ester，TPA，浙江聯(lián)科生物有限公司)；瑞氏、吉姆薩粉劑(北京索萊寶科技有限公司)；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的粒細(xì)胞單克隆抗體(fluorescein isothiocyanate-CD14，F(xiàn)ITC-CD14)、別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的粒細(xì)胞單克隆抗體(allophycocyanin-CD11b，APC-CD11b)、藻紅蛋白標(biāo)記的巨噬細(xì)胞單克隆抗體(p-phycoerythin-CD42，PE-CD42)和藻紅蛋白標(biāo)記的巨核細(xì)胞單克隆抗體(p-phycoerythin-CD41a，PE-CD41a)均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(globin transcription factor 1，GATA-1)抗體、造血轉(zhuǎn)錄因子1(hematopoietic transcription factor，PU.1)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗人單克隆抗體為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 漆姑草醇提物制備

漆姑草全草50 g用70%乙醇，50℃水浴提取4 h，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮，得HSJ干浸膏，制備20 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分組與處理

K562細(xì)胞(源自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))置于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于96孔板中按1×10個(gè)/mL接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，設(shè)HSJ高、中、低濃度(分別為250、125、62.5 μg/mL)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(等體積1640培養(yǎng)基)，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

采用MTT法，收集細(xì)胞，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后，3 000 r/min離心15 min，棄上清。每孔加入200 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度

D

(490)值，取平均值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

1.4.2 NBT還原實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，離心棄上清，沉淀加1 mg/mL的NBT 200 μL和100 μg/mL的佛波酯10 μL混勻，37℃避光溫育1 h，離心棄上清，每個(gè)樣本分別涂片3次，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(胞質(zhì)內(nèi)含有灰藍(lán)顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞)，取平均值計(jì)算NBT還原率。

1.4.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

采用瑞氏-吉姆薩染色法，收集細(xì)胞懸液，PBS洗滌1次，離心棄上清，沉淀加100 μL PBS重懸后涂片，加甲醇固定10 min，雙蒸水沖洗3 min，晾干，加瑞氏-吉姆薩染色工作液(瑞氏-吉姆薩染色原液∶PBS=1∶9，

V/V

)染色30 min，自來(lái)水沖洗3 min，晾干，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4.4 分化相關(guān)抗原 CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗2次，將細(xì)胞分至A、B兩只流式管，A管加APC-CD11b單克隆抗體3 μL、FITCCD14單克隆抗體5 μL、PE-CD41a單克隆抗體5 μL混勻；B管加PE-CD42b單克隆抗體5 μL混勻，室溫避光靜置孵育15 min，PBS洗滌1次，重新加PBS到流式管刻度線處，吹打均勻，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b、CD14、CD41a和CD42b的熒光強(qiáng)度，分析分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。

1.4.5 K562細(xì)胞GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次，加裂解液(細(xì)胞裂解液∶蛋白酶抑制劑=99∶1，

V

/

V

)，冰上裂解15 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量后制樣，煮沸5 min。以12%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，濕電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下封閉1.5 h后加入適當(dāng)濃度的一抗(GATA-1單抗1∶1 000稀釋?zhuān)琍U.1單抗1∶500稀釋?zhuān)瑑?nèi)參照GAPDH單抗為1∶5 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗稀釋液(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光、顯影、定影，掃描灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)不同濃度HSJ作用48 h后，K562細(xì)胞增殖能力受到不同程度抑制(

P

＜0.05)，隨著濃度的增加K562細(xì)胞增殖抑制率增加，見(jiàn)表1。

表1 HSJ對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制率和NBT還原能力的影響(±s，n=3)

2.2 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞NBT還原能力的影響

與對(duì)照組相比，250、125、62.5 μg/mL HSJ組K562細(xì)胞的NBT還原率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響

陰性對(duì)照組細(xì)胞的胞核呈圓形，結(jié)構(gòu)完整，核漿比例較大；經(jīng)不同濃度HSJ處理后，細(xì)胞核漿比例減小，出現(xiàn)分葉狀細(xì)胞核，兩葉、三葉或者多葉，部分細(xì)胞核凹陷出現(xiàn)明顯的細(xì)胞分化狀態(tài)，隨著給藥濃度的增加細(xì)胞核縮小程度越大，分化細(xì)胞越多，見(jiàn)圖1。

圖1 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，經(jīng)不同濃度HSJ作用后，K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD41a和CD42b陽(yáng)性表達(dá)率均不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，見(jiàn)表2和圖2。

表2 HSJ對(duì)分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b陽(yáng)性表達(dá)率的影響(±s，%)

2.5 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，經(jīng)不同濃度HSJ作用48 h后，GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)水平均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

圖2 漆姑草對(duì)K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b、CD14、CD41a、CD42b表達(dá)的影響

圖3 HSJ對(duì)K562細(xì)胞GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)的影響

表3 HSJ對(duì)K562細(xì)胞GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

白血病是造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病，骨髓造血干細(xì)胞失去分化成熟的能力而停滯在幼稚階段，大量原始與早期幼稚血細(xì)胞急劇增生直接釋放到血液中，被稱(chēng)為“液體腫瘤”，浸潤(rùn)其他臟器組織，正常的造血功能被抑制，其治療可采用放療、化療和骨髓移植等。K562細(xì)胞為慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在K562細(xì)胞向紅系、粒系、巨核系細(xì)胞方向分化時(shí)，K562細(xì)胞的形態(tài)、功能、分化相關(guān)抗原和蛋白表達(dá)均會(huì)發(fā)生一系列變化。中藥具有高效低毒、資源豐富、標(biāo)本兼治的特點(diǎn)，且具有治療效果溫和、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，故從其中尋找誘導(dǎo)分化劑已成為白血病誘導(dǎo)分化治療的熱點(diǎn)之一。漆姑草民間用于白血病的治療，療效確切，但其治療白血病的機(jī)制研究較少，本文以K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討漆姑草醇提取物對(duì)K562細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用，并分析其誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制。

白血病細(xì)胞持續(xù)分裂和不斷增殖是癌細(xì)胞的一個(gè)重要特征，細(xì)胞的分化成熟度與細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)，即細(xì)胞分化越成熟，其生長(zhǎng)能力越弱，因此藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力，是其分化的一個(gè)重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，不同濃度HSJ對(duì)K562細(xì)胞增殖能力具有抑制作用；K562細(xì)胞經(jīng)250、125、62.5 μg/mL HSJ作用48 h后，細(xì)胞向成熟方向改變并出現(xiàn)明顯的分化形態(tài)；在佛波酯的激發(fā)下，成熟度較高的細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生增多，可將水溶性淡黃色的活性染料NBT還原為不溶性藍(lán)黑色顆粒-甲臜。NBT還原實(shí)驗(yàn)顯示，與陰性對(duì)照組相比，NBT陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，K562細(xì)胞功能趨近成熟。采用瑞氏-吉姆薩染色法，細(xì)胞包漿呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，從形態(tài)學(xué)的角度直觀觀察，給藥組K562細(xì)胞核直徑變小，出現(xiàn)明顯的分葉現(xiàn)象，兩葉、三葉或者多葉，核漿比例減少，核仁減少或消失，核染色質(zhì)濃縮，胞漿豐富，出現(xiàn)明顯的分化形態(tài)。白血病細(xì)胞與正常造血干、祖細(xì)胞一樣，在分化成熟過(guò)程中細(xì)胞表面的抗原標(biāo)志不斷發(fā)生變化，在獲得一些新抗原的同時(shí)也丟失了某些原有的抗原。因此，不同的分化抗原可作為細(xì)胞分化各個(gè)階段的表面標(biāo)志，根據(jù)分化抗原表達(dá)可較精確判斷細(xì)胞所處的分化階段。成熟粒系細(xì)胞分化的標(biāo)志CD11b、單核細(xì)胞標(biāo)志抗原CD14、巨噬細(xì)胞表面分化抗原CD41a、巨核細(xì)胞分化抗原CD42b，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化相關(guān)抗原陽(yáng)性表達(dá)率可以反映細(xì)胞的分化方向及階段。本研究結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，不同濃度HSJ作用K562細(xì)胞48 h后，CD14、CD11b、CD41a和CD42b陽(yáng)性表達(dá)率均增加(

P

＜0.05)。GATA結(jié)構(gòu)是其他紅系非珠蛋白基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子活化所必需的，被稱(chēng)為紅系特異轉(zhuǎn)錄因子的

GATA-1

基因主要調(diào)控紅系和巨核系的發(fā)育，而在粒系、單核系的成熟過(guò)程中則受抑制；PU.1是從原癌基因

SpI-1

的產(chǎn)物中分離出的一種新的蛋白因子，不在紅系和T細(xì)胞表達(dá)，但促進(jìn)白血病細(xì)胞向髓系方向發(fā)育。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)GATA-1蛋白、PU.1蛋白表達(dá)增加，提示HSJ能誘導(dǎo)K562細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞方向分化。

本研究從細(xì)胞的形態(tài)、功能、分化相關(guān)抗原及蛋白表達(dá)等方面證實(shí)HSJ能誘導(dǎo)K562細(xì)胞向成熟細(xì)胞方向分化，結(jié)合臨床成熟分化誘導(dǎo)劑，存在不同程度的毒副作用，且單用復(fù)發(fā)率相當(dāng)高，臨床耐藥病例日漸增多的現(xiàn)狀，開(kāi)發(fā)高效低毒的天然分化誘導(dǎo)劑治療白血病，成為研究熱點(diǎn)，漆姑草作為民間治療白血病的天然藥物，其誘導(dǎo)分化能力被進(jìn)一步證實(shí)，但誘導(dǎo)分化的機(jī)制還不是很明確，為了更好的開(kāi)發(fā)利用漆姑草資源，其分化誘導(dǎo)的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。