甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞凋亡相關(guān)lncRNA的篩選及功能研究

馬順鵬，王全凱，王 苗 ，宋佳陽，烏瀚寶櫟爾，謝廣云，許建寧，

(1．中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；2．中國疾病預(yù)防控制中心化學(xué)污染與健康安全重點實驗室，北京 100050)

環(huán)境有害化學(xué)物質(zhì)的潛在致癌性風(fēng)險是其安全性評價必不可少的內(nèi)容，細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗作為評價化學(xué)物致癌作用的重要手段，與嚙齒類動物的致癌性試驗相比，能夠有效縮短檢測致癌作用時間，減少實驗動物的使用數(shù)量，從而為新化學(xué)品的生產(chǎn)、使用和職業(yè)人群的防護(hù)工作提供重要的證據(jù)支持。

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)作為雙官能團(tuán)單體的一種，可以通過雙鍵和環(huán)氧基團(tuán)參與離子型或自由基的交聯(lián)聚合反應(yīng)，主要用于丙烯酸樹脂、乙烯基和環(huán)氧樹脂的生產(chǎn)。在牙科用密封膠、復(fù)合材料和黏合劑、骨復(fù)合材料、粉末涂料、水凝膠鏡片和食品接觸材料中均有廣泛應(yīng)用。近期世界衛(wèi)生組織下的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC完成了對GMA的致癌性評估，根據(jù)“強(qiáng)有力”的致癌機(jī)制證據(jù)以及“充分”的實驗證據(jù)，GMA被歸類為“對人類很可能致癌物質(zhì)”(Group 2A)。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在GMA誘導(dǎo)人支氣管上皮16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，可致基因表達(dá)譜和表觀遺傳層面發(fā)生異常改變，但這一過程涉及的細(xì)胞功能改變及其機(jī)制仍需作進(jìn)一步探討。有研究表明，細(xì)胞凋亡水平的改變與哺乳動物細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展過程密切相關(guān)。因此，本研究擬對GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞凋亡率改變進(jìn)行研究，并探究其可能發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

GMA，購于美國Sigma公司，純度≥98.5%；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；胰蛋白酶、EDTA-Na購于美國Amresco公司；MEM培養(yǎng)基粉購于美國Hyclone公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購于美國Gibco公司；100×的青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞固定液和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC Annexin-V Apoptosis Detection Kit with PI)均購自美國BioLegend公司，Trizol試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2×PCR master mix購于美國Arraystar公司。

CO培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；臺式高速低溫離心機(jī)購于美國BECKMAN公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購于美國ACEA艾森生物公司；紫外可見分光光度計購于美國UNICO公司；7900HT Fast Real-Time PCR儀購于美國Biosystems公司；ND-1000分光光度計購于美國NanoDrop公司；ViiA 7實時定量PCR反應(yīng)體系購于美國Applied Biosystems公司；Arraystar Human lncRNA Microarray V4.0芯片技術(shù)服務(wù)和引物設(shè)計的技術(shù)支持由上?？党缮锕咎峁?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化

人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)來自美國加利福尼亞大學(xué)。液氮凍存的16HBE細(xì)胞復(fù)蘇后，使用10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液，于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；谡n題組既往關(guān)于GMA的細(xì)胞毒性和克隆形成率的研究結(jié)論，我們選擇8 μg/mL的GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行接種，24 h后向培養(yǎng)液中加入6 μL濃度為8 μg/mL的GMA進(jìn)行染毒(DMSO作為溶劑對照)。每次染毒時間為72 h，間隔24 h后進(jìn)行2次染毒，重復(fù)染毒3次后結(jié)束染毒，記為第1代，MEM培養(yǎng)液調(diào)整為5%FBS繼續(xù)培養(yǎng)。課題組既往研究已經(jīng)證實，傳代培養(yǎng)至第30代，GMA染毒組的16HBE細(xì)胞具備惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生物學(xué)特性。基于此，我們將第10、20和30代的GMA染毒組細(xì)胞，記為轉(zhuǎn)化前、中和后期。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測

分別收集GMA染毒組和DMSO對照組的第10、20和30代細(xì)胞，對細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測。胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，然后細(xì)胞固定液洗滌2次，1 200 r/min離心5 min；加入含Ca的緩沖液混懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10個/mL；取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管，依次加入5 μL的FITC Annexin-V，10 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)，渦輪振蕩器振蕩，保證細(xì)胞均勻分布，25℃避光孵育15 min，最后加入400 μL的含Ca的緩沖液，上機(jī)檢測。其中Annexin-V陽性、PI陰性代表凋亡早期的細(xì)胞，位于流式細(xì)胞象限圖的右下方，凋亡早期細(xì)胞的比例Annexin-V陽性，而PI陽性代表晚期細(xì)胞的凋亡比例，位于象限圖的右上方，兩者之和即為細(xì)胞凋亡率。

1.4 LncRNA芯片分析

收集GMA染毒組和DMSO對照組的第10、20和30代細(xì)胞，使用Trizol提取總RNA，無核酸酶水和RNA清潔純化試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行分離純化，然后通過NanoDrop ND-1000檢測RNA的濃度和純度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分離提取符合要求的總RNA樣品后，Arraystar RNA Flash標(biāo)記試劑盒用于樣品標(biāo)記，然后使用Agilent SureHyb進(jìn)行雜交實驗，雜交完成后洗滌芯片，采用Agilent DNA Microarray Scanner掃描芯片的信號值，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理得到lncRNA表達(dá)譜的差異表達(dá)情況。

最后，通過檢索GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中第10、20和30代lncRNA表達(dá)譜的差異表達(dá)結(jié)果，篩選得到細(xì)胞凋亡相關(guān)lncRNA，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA CFLAR-AS1的靶基因和可能存在的生物學(xué)功能。

1.5 qPCR檢測lncRNA CFLAR-AS1的表達(dá)水平

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)將提取好的總RNA樣品合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反應(yīng)。反應(yīng)體系(10 μL)包括：2×Master Mix 5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2 μL及無核酸酶水2 μL；擴(kuò)增條件為：95℃，預(yù)變性10 min；95℃，變性10 s；60℃，退火60 s，40個PCR循環(huán)。分別以管家基因

β-actin

為內(nèi)參，同時期DMSO對照組的平均值為基準(zhǔn)， 2的方法計算相對表達(dá)水平。管家基因及目的基因的引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，細(xì)胞凋亡率、lncRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞凋亡率的檢測結(jié)果

取DMSO對照組和GMA染毒組的第10、20和30代細(xì)胞分別檢測其細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如表2所示。與同時期DMSO對照組相比，第10代GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，且兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而第20代GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率低于同時期DMSO對照組(

P

＜0.05)，第30代GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率與同時期DMSO對照組比較無明顯差異(

P

＞0.05)。

表2 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程細(xì)胞凋亡率的變化情況(±s，%)

2.2 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞凋亡相關(guān)lncRNA的芯片篩選結(jié)果

對GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的3個時期lncRNA芯片數(shù)據(jù)和lncRNA臨近編碼基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出與細(xì)胞凋亡過程相關(guān)的lncRNA(表3)。發(fā)現(xiàn)與同時期DMSO對照組相比，lncRNA CFLAR-AS1在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第10、20和30代分別下調(diào)22%、上調(diào)244%和下調(diào)30%。其他篩選到的lncRNA芯片分析結(jié)果在這3個時期無明顯改變。

2.3 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中l(wèi)ncRNA CFLAR-AS1的表達(dá)水平

qPCR檢測結(jié)果見表4，在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，與同時期DMSO對照組細(xì)胞相比，lncRNA CFLAR-AS1在第10、20代細(xì)胞中分別下調(diào)42%、上調(diào)442%(均為

P

＜0.05)，第30代細(xì)胞與同時期對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＞0.05)。此外，3個時期的相對表達(dá)水平變化趨勢與芯片分析的結(jié)果一致。

表3 細(xì)胞凋亡相關(guān)差異lncRNA的芯片分析結(jié)果

表4 qPCR檢測不同時期16HBE細(xì)胞lncRNA CFLAR-AS1的相對表達(dá)水平

2.4 LncRNA CFLAR-AS1的可能作用靶點CFLAR芯片分析結(jié)果

為進(jìn)一步探究lncRNA CFLAR-AS1的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，檢索NCBI BLAST、DIANA TOOL等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，lncRNA CFLAR-AS1是CFLAR的反義RNA(見圖1)，提示CFLAR很可能是CFLAR-AS1的一個作用靶點。芯片分析結(jié)果顯示，CFLAR在第10、20和30代的差異倍數(shù)均未超過2倍，分別上調(diào)27%、下調(diào)30.6%和下調(diào)31%。

圖1 LncRNA CFLAR-AS1與CFLAR在2號染色體上的位置關(guān)系

3 討論

細(xì)胞凋亡是動物細(xì)胞程序性死亡的一種形式。有研究表明，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化如接觸外源性化學(xué)物時，凋亡信號通路可以被激活，通過產(chǎn)生凋亡細(xì)胞緩和細(xì)胞損傷的發(fā)生。本研究采用GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，觀察細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的第10、20和30代GMA染毒細(xì)胞的凋亡率變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與同時期DMSO對照組相比，第10代GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，第20代GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率降低，第30代兩組細(xì)胞相比較無明顯差異。這表明在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的前期，細(xì)胞凋亡參與GMA重復(fù)染毒16HBE細(xì)胞的早期損傷修復(fù)。隨著細(xì)胞損傷修復(fù)的完成，與同時期對照細(xì)胞相比，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中期GMA染毒組的細(xì)胞凋亡率降低，轉(zhuǎn)化完成后兩者凋亡率無明顯差異。

細(xì)胞凋亡這一過程伴隨著多種基因的激活及相互調(diào)控作用，其中細(xì)胞凋亡的負(fù)向信號傳導(dǎo)途徑使得發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞避免死亡，從而進(jìn)一步完成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。許多蛋白質(zhì)家族可作為負(fù)向調(diào)控因子抑制細(xì)胞凋亡，如抗凋亡因子Bcl-2蛋白，促生長因子CFLAR，BNIP3和FADD等。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可在表觀遺傳水平上，通過調(diào)控凋亡基因表達(dá)影響細(xì)胞凋亡率變化。我們在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的第10、20和30代芯片分析結(jié)果中，通過篩選細(xì)胞凋亡相關(guān)差異lncRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNA CFLAR-AS1在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第10、20和30代分別下調(diào)22%、上調(diào)244%和下調(diào)30%。qPCR驗證lncRNA CFLAR-AS1的表達(dá)水平，lncRNA CFLAR-AS1在第10、20和30代分別下調(diào)42%、上調(diào)442%和下調(diào)9%，第10和20代的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果，我們推測在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中期，lncRNA CFLAR-AS1起著抑制細(xì)胞凋亡的作用。

LncRNA CFLAR-AS1是

CFLAR

基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物(natural antisense transcripts，NATs)。有研究表明，NATs可能參與調(diào)控其正義RNA編碼蛋白質(zhì)。CFLAR作為細(xì)胞凋亡負(fù)向調(diào)控因子，通過表達(dá)FLIP蛋白抑制細(xì)胞凋亡。但我們在mRNA表達(dá)譜芯片分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，3個時期CFLAR的差異倍數(shù)均未超過2倍，這提示lncRNA CFLAR-AS1可能不是通過CFLAR的NATs來影響細(xì)胞凋亡率。

綜上，在GMA誘導(dǎo)16HBE惡性轉(zhuǎn)化過程中，轉(zhuǎn)化前期凋亡率升高，轉(zhuǎn)化中期凋亡率下降，這一時期lncRNA CFLAR-AS1可能發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。