EZH2表位肽在多發(fā)性骨髓瘤中的預(yù)測和驗證

鐘 赟 劉 哲

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一類源自于B細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它占所有惡性腫瘤的1%，占到了血液系統(tǒng)惡性腫瘤的13.4%，是血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第二的惡性腫瘤[1]。MM是由漿細胞單克隆性增殖引起，最終導(dǎo)致靶器官受損。目前，盡管部分患者通過化療、靶向治療、造血干細胞移植能得到暫時緩解，但是最后發(fā)現(xiàn)大部分患者仍會復(fù)發(fā)[2]，進而出現(xiàn)大多數(shù)患者仍無法治愈的結(jié)果。因此我們亟待尋求一種確實有效的治療方法，以期望能治愈多發(fā)性骨髓瘤。

染色質(zhì)水平的修飾是基因表達調(diào)控的重要途徑，(PcG)蛋白介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄抑制是目前在基因表達調(diào)控方面的研究熱點[3]。近階段的研究發(fā)現(xiàn)，PcG蛋白與X 染色體的失活、干細胞分化、細胞癌變等存在密切的關(guān)系，而EZH2蛋白是PcG蛋白核心復(fù)合體的重要構(gòu)成部分。研究者在多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白的高表達，如前列腺癌、乳腺癌、MDS及淋巴瘤等，并且發(fā)現(xiàn) EZH2 蛋白的高表達常與預(yù)后相關(guān)，它預(yù)示腫瘤惡性程度高且有發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移的傾向[4]。一般認為 EZH2 蛋白通過其甲基轉(zhuǎn)移酶活性在染色體水平抑制基因轉(zhuǎn)錄。正常的骨髓漿細胞不表達 EZH2，當(dāng)發(fā)生漿細胞腫瘤時，EZH2會隨著疾病進展逐步上調(diào)表達。在過去的的研究中，有學(xué)者用 siRNA的方法將細胞株中的EZH2表達沉默，發(fā)現(xiàn)EZH2表達水平下調(diào)的腫瘤細胞株停止生長[5]。 因此，我們基于上述研究成果，初步可預(yù)測在腫瘤中大量表達的EZH2蛋白，實際上在腫瘤細胞分化、生長、發(fā)展過程中起到了抗凋亡分子的某些作用，因此可認為EZH2蛋白是一種較為理想的惡性腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療假想靶點。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對EZH2蛋白進行HIA-A0201限制性CTL抗原表位的初步預(yù)測，驗證該表位肽是生理和病理情況下都存在的，為多發(fā)性骨髓瘤免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2018年12月的初診且按NCCN診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為多發(fā)性骨髓瘤的患者30例作為MM組，取同期健康體檢者30例作為健康對照組，本實驗研究中的相關(guān)部分已獲得所在醫(yī)院的倫理委員會的批準(zhǔn)，并與患者、家屬均簽署了相關(guān)知情等告知性同意書。

1.2 試劑和儀器

人TAP-缺陷型細胞株T2(HLA-A0201)(上海復(fù)祥生物科技有限公司提供)；流感病毒基質(zhì)蛋白肽段(上海波泰生物科技有限公司)；PBS緩沖液(上海生工生物工程有限公司提供)，RPMI1640培養(yǎng)液、FBS(GIBCO公司)；胞外布雷菲德菌素(上海同田生物技術(shù)有限公司)HIV-l pol肽段、FITC標(biāo)記小鼠抗人HLA-A02單克隆抗體(北京表源生物技術(shù)有限公司)；BB7.2與PE標(biāo)記的aa27及aa670肽段四聚體(北京表源生物技術(shù)有限公司)；β2微球蛋白(Raybiotech公司)。

主要儀器和設(shè)備：流式細胞儀(Beckman Coulter公司)；96孔板(丹麥NUNC公司)；二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司生產(chǎn))；無菌超凈工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠生產(chǎn))；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械一廠生產(chǎn))；IMT-2型倒置顯微鏡(日本olympus公司生產(chǎn))。

1.3 生物信息軟件

本研究采用以下生物信息學(xué)軟件NCBI NP-00309(http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)；BIMAS(http：//www-bimas.cit.nih.gov/ molbio/hla_bind)；SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/ Scripts/ MHCScrver.dll/ EpitopePrediction.htm)。

1.4 主要方法

1.4.1 HLA-A0201限制性EZH2蛋白CTL表位肽預(yù)測 根據(jù)在Genbank中登記的相關(guān)數(shù)據(jù)，查找出EZH2蛋白的信息，從而確定好EZH2的蛋白氨基酸序列，并由NIH/BIMAS系統(tǒng)預(yù)測出數(shù)個EZH2蛋白相關(guān)的HLA-A0201限制性的CTL表位肽構(gòu)成，再通過SYFPEITHI系統(tǒng)對上述表位肽進行驗證，選取累計積分最高的肽片段。使用超基序方案對已預(yù)測出的CTL表位肽片段進行修飾以進一步提高積分。我們通過NIH/BIMAS提供表位肽預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)站點，將EZH2蛋白序列檢測出分別獨立預(yù)測得分值較高的抗原多肽，預(yù)測出多條表位肽，并通過量化基序方案以及超基序方案進一步篩選出最合適的2條表位肽。

1.4.2 多肽的合成與驗證 在研究中所使用的全部肽段均由上海波泰生物科技公司合成并驗證。結(jié)合文獻報道及相關(guān)預(yù)測，我們在實驗中預(yù)測并選取分別合成出了2條HLA A0201陽性肽(HIV-1 pol肽段，序列：ILKEPVHGV；流感病毒基質(zhì)蛋白肽段，序列：GILGFVFTL；)作為本實驗的陽性對照。

在線篩選出2條EZH2高積分肽段，同時使用HLA-A0201+T2雜交瘤細胞驗證肽段的親和力、穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上篩選出具備高親和力和穩(wěn)定性的一條肽段。

1.4.3 T2細胞表位肽結(jié)合親和實驗 將細胞密度為2×105/孔T2細胞混懸液制備備用，并分別依次接種于24孔細胞培養(yǎng)板中備用；實驗中按方案設(shè)立分組為實驗組、陽性對照組、空白對照組，并在實驗中每個實驗組設(shè)3個副孔，通過調(diào)整后每孔含2.5 μg/mL β2微球蛋白。實驗中每孔加入相應(yīng)的候選肽段作為實驗組，其余部分孔位中加入對照肽段的為陽性對照組，剩余的未加肽段的T2細胞孔位作為空白對照。后將所有細胞孵育18 h，完成后分別收集細胞，洗滌3次，再分別加入FITC標(biāo)記的HLA-A0201單克隆抗體，并通過流式細胞儀檢測平均熒光強度。

試驗中使用熒光系數(shù)(FI)作為衡量親和力的指標(biāo)，熒光系數(shù)>1的表位肽被認為HLA-A0201的分子具有高親和力，熒光系數(shù)由以下公式計算得到：熒光系數(shù)(FI)=(樣本平均熒光強度-空白對照平均熒光強度)/空白對照平均熒光強度。

1.4.4 T2細胞表位肽結(jié)合穩(wěn)定性實驗 分別將密度為1×105/孔的混懸液接種到96孔細胞培養(yǎng)板中備用，再分別依次加入β2微球蛋白，分組為無血清1640培養(yǎng)基以及對照肽段和相應(yīng)的候選肽段，并共同孵育18 h后，再次洗滌細胞后孵育1 h，并預(yù)設(shè)不同的時間點(0，2，4，8，12，24 h)按計劃分次收集細胞。每一個實驗組設(shè)置3個副孔，分別加入FITC標(biāo)記的HLA-A0201單克隆抗體，并盡早使用流式細胞儀檢測平均熒光強度。

1.4.5 檢測患者、健康對照者所篩選肽段相對應(yīng)五聚體陽性細胞毒性T細胞 分別按分組情況，收集多發(fā)性骨髓瘤患者及健康對照者的外周血5 ml，并提取外周血單個核細胞，并將1×106個單個核細胞加入2 μL同型對照和所篩選表位肽對應(yīng)的五聚體，孵育40 min，加入FITC標(biāo)記的CD8+單克隆抗體，取出后進行流式細胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism6軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A0201限制性EZH2蛋白CTL表位肽預(yù)測

EZH2蛋白氨基酸序列的確定：我們在Genbank中登記的數(shù)據(jù)中查找到了EZH2蛋白，它由746個氨基酸殘基組成，Genbank登錄號為：AAC51520.1，其編碼的蛋白質(zhì)序列如下：mgqtgkksek gpvcwrkrvk seymrlrqlk rfrradevks mfssnrqkil erteilnqew kqrriqpvhi ltsvsslrgt recsvtsdld fptqviplkt lnavasvpim yswsplqqnf mvedetvlhn ipymgdevld qdgtfieeli knydgkvhgd recgfindei fvelvnalgq yndddddddg ddpeereekq kdledhrddk esrpprkfps dkifeaissm fpdkgtaeel kekykelteq qlpgalppec tpnidgpnak svqreqslhs fhtlfcrrcf kydcflhpfh atpntykrkn tetaldnkpc gpqcyqhleg akefaaalta eriktppkrp ggrrrgrlpn nssrpstpti nvleskdtds dreagtetgg enndkeeeek kdetssssea nsrcqtpikm kpnieppenv ewsgaeasmf rvligtyydn fcaiarligt ktcrqvyefr vkessiiapa paedvdtppr kkkrkhrlwa ahcrkiqlkk dgssnhvyny qpcdhprqpc dsscpcviaq nfcekfcqcs secqnrfpgc rckaqcntkq cpcylavrec dpdlcltcga adhwdsknvs ckncsiqrgs kkhlllapsd vagwgifikd pvqknefise ycgeiisqde adrrgkvydk ymcsflfnln ndfvvdatrk gnkirfanhs vnpncyakvm mvngdhrigi fakraiqtge elffdyrysq adalkyvgie remeip。通過CTL表位肽在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測出積分較高的肽段：YMCSFLFNL 及 SQADALKYV。如表1。

表1 CTL表位肽對EZH2積分較高肽段的預(yù)測

完成 EZH2-HLA0201 特異性肽段篩選，篩選出“YMCSFLFNL”肽段進行下一步功能實驗，實驗結(jié)果表明“YMCSFLFNL”肽段與HLA-A020結(jié)合是穩(wěn)定的。見圖1、2。

圖1 EZH2 肽段與T2細胞結(jié)合力實驗結(jié)果

圖2 EZH2 肽段與T2細胞結(jié)合穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.2 HLA-A0201限制性EZH2蛋白CTL表位肽驗證

初步證明合成的EZH2-CTLS五聚體在健康供者及患者中都存在，并發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi) EZH2-CTLS水平顯著高于健康對照者。見圖3。

圖3 患者和健康對照者EZH2-CTLs水平測定

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是血液系統(tǒng)惡性腫瘤第二高發(fā)的，目前治療中大部分患者仍不能治愈。多發(fā)性骨髓瘤的疾病特點是單克隆的漿細胞呈惡性增殖，從而導(dǎo)致多發(fā)骨質(zhì)破壞、并進一步導(dǎo)致腎功能衰竭等在內(nèi)的各個靶器官的功能性損害。我們希望設(shè)計出一種全新的治療方式來達到穩(wěn)定甚至起到清除那些已經(jīng)通過自體造血干細胞移植來達到緩解的或者穩(wěn)定的患者體內(nèi)的可能存在的微小殘留病灶。

免疫治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點，免疫治療或許可以成為治愈MM的一種新的選擇。研究者一直積極探索了許多MM的靶點，比如未折疊蛋白(XBP1)[6]、熱休克蛋白(HSP)[7]及 CD138+[8]等，但上述靶點均存在相當(dāng)?shù)木窒扌訹9]。近來的研究發(fā)現(xiàn)免疫治療就是這樣一個無極接近設(shè)想的治療效果的理想的選擇，免疫治療可以有效清除骨髓瘤患者體內(nèi)存在的微小殘留病灶，甚至可以達到替代常規(guī)化療鞏固療效的作用。今年來已經(jīng)有少數(shù)學(xué)者通過使用來自患者血清的獨特型免疫球蛋白作為疫苗進行免疫治療，但是結(jié)果并不理想，因為研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)這種多發(fā)性骨髓瘤特異性T細胞被清除了，而且這種獨特型免疫球蛋白肽段也不是所有骨髓瘤患者的共同腫瘤抗原[10]。為了能提供更有效的免疫治療策略，我們需要找到一種骨髓瘤患者共有的腫瘤特異性抗原。EZH2具有理想腫瘤抗原的特性，在很多腫瘤中高表達，最重要的是EZH2對于腫瘤細胞的生存至關(guān)重要，下調(diào)或者抑制EZH2的表達會使腫瘤細胞顯著凋亡[11-12]。

本研究通過在線篩選出EZH2高積分肽段，同時通過 T2細胞實驗進一步篩選出具備高親和力及穩(wěn)定性的一條肽段，合成五聚體后已分別在健康供者及患者外周血中檢測到不同水平的EZH2-CTLs，證明該表位肽是在生理及病理情況下自然存在的，為后續(xù)EZH2表位肽作為MM治療的靶點運用于臨床奠定了基礎(chǔ)。