糖尿病性潰瘍動物模型的制備及評價▲

陳壯麗 盧 維 李杰輝

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530023，電子郵箱：914453972@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院創(chuàng)面修復、周圍血管科，南寧市 530023)

【提要】 隨著社會經濟的發(fā)展，糖尿病的患病人數(shù)逐年增加，糖尿病性潰瘍等相關并發(fā)癥的發(fā)病率也呈上升趨勢，嚴重地威脅居民的健康。糖尿病性潰瘍動物模型的制備有利于深入研究糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的發(fā)病機制，為臨床診治疾病提供強有力的科研證據(jù)和藥物作用機制。本文就糖尿病性潰瘍動物模型的研究現(xiàn)狀及其進展進行綜述。

糖尿病是常見的慢性疾病之一，糖尿病及其相關并發(fā)癥已經成為威脅我國居民健康的重大問題之一。據(jù)統(tǒng)計，2017年全球約有4.51億人(18～99歲)患有糖尿病，預計到2045年糖尿病患病人數(shù)將增至6.93億[1]。研究顯示，大多數(shù)糖尿病足是由缺血性、神經病理性或混合性神經缺血性異常引起，是糖尿病常見的嚴重并發(fā)癥之一[2]。與正常人的創(chuàng)面相比，糖尿病患者由于長期處于高糖狀態(tài)，其創(chuàng)面修復細胞(成纖維細胞、上皮細胞、血管內皮細胞等)發(fā)生病變、血管內皮損傷，創(chuàng)面潰瘍難愈合且反復難治[3]。隨著對糖尿病性潰瘍發(fā)病機制研究的逐步深入，其治療手段也取得很大進步，如抗感染、負壓引流、高壓氧療、生長因子、分子生物學和組織工程技術、中醫(yī)中藥等對糖尿病性潰瘍均有一定的療效。實驗研究可為疾病的治療提供科研證據(jù)，因此，糖尿病潰瘍動物模型的建立對研究糖尿病性潰瘍具有一定意義。本研究主要闡述糖尿病性潰瘍動物模型的制備及其研究近況。

1 糖尿病動物模型的構建方法

目前，大多數(shù)研究選擇鼠類作為糖尿病動物模型，構建方法主要有鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射誘導法或者STZ注射結合高糖高脂飼料喂養(yǎng)法，或者直接選擇自發(fā)性動物模型、轉基因糖尿病動物模型(基因敲除糖尿病動物模型)。但對于造模過程中的血糖檢測標準、檢測時間和STZ劑量問題，目前尚無統(tǒng)一標準。

1.1 STZ誘導法 化學藥物在誘導實驗性糖尿病動物模型中得到廣泛應用，由于STZ具有毒性小、穩(wěn)定性好、成模速度快等優(yōu)點而被廣泛使用，其藥物可通過激活機體自身免疫選擇性，導致胰島B細胞壞死、胰島素缺乏，使血糖升高或者產生針對胰島B細胞的自身抗體，誘導糖尿病的發(fā)生。有研究顯示，多次小劑量(50 mg/kg)STZ腹腔注射較單次大劑量(150 mg/kg)注射能更有效地建立糖尿病小鼠模型[4]。多次腹腔注射STZ(60 mg/kg或70 mg/kg)誘導小鼠成模率高且血糖水平穩(wěn)定，可持續(xù)損傷胰島細胞，導致機體自身免疫系統(tǒng)紊亂，與臨床上Ⅰ型糖尿病的發(fā)病機制相似[5-6]。

1.2 高脂飲食結合STZ誘導法 本法先通過高脂飲食使鼠類產生胰島素抵抗，之后腹腔注射STZ破壞胰島細胞，研究顯示，該方法可提高成模率、模型穩(wěn)定性及變異性，目前應用較為廣泛。例如，陳欣等[7]采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠一段時間(1個月)后，連續(xù)給予小劑量STZ(25 mg/kg)腹腔注射2 d，結果顯示該法可以構建穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病動物模型[7]。李友山等[8]采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠(80～100 g)1個月后，單次腹腔注射 STZ 40 mg/kg，可構造較為可靠的糖尿病大鼠模型。此研究在糖尿病大鼠模型基礎上，人為創(chuàng)建潰瘍創(chuàng)面，動態(tài)觀察創(chuàng)面愈合過程。此造模方法可以觀察到糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的組織病理學特點，為研究糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的機制和治療提供思路。以上文獻提示高糖高脂飲食喂養(yǎng)1～2個月左右，可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，同時聯(lián)合STZ注射可誘導胰島細胞損傷從而構建糖尿病大鼠模型[9]，但不同的STZ給藥劑量，糖尿病的病情會有所差異[10]，但不可否認的是該方法可獲得較穩(wěn)定的糖尿病動物模型。

1.3 自發(fā)性糖尿病動物模型 自發(fā)性糖尿病動物模型是動物自然發(fā)生糖尿病，或通過遺傳培育保留的糖尿病模型，該模型與人類Ⅱ型糖尿病的臨床癥狀相似，常用于建立模型的動物有db/db小鼠、ob/ob小鼠、KK-AY小鼠、GK大鼠等[11]。db/db小鼠是模擬人類Ⅱ型糖尿病模型的良好動物，此小鼠變異程度高，具有穩(wěn)定的高血糖、胰島素抵抗和血脂異常等狀態(tài)，適用于臨床上對糖尿病及其相關并發(fā)癥的研究[12-13]。池駿等[14]通過敲除瘦素基因建立糖尿病小鼠模型，該小鼠模型具有自發(fā)性、高重復性和穩(wěn)定的Ⅱ型糖尿病癥狀表型等特點，瘦素基因敲除小鼠與ob/ob小鼠較相似，為糖尿病相關疾病的研究提供了重要的造模條件，但瘦素基因缺陷導致的糖尿病在臨床上極為少見，與患者發(fā)病機制存在一定差異。KK-AY小鼠是KK小鼠通過轉入黃色肥胖基因而形成的一種糖尿病動物模型，此小鼠可用于建立多種糖尿病并發(fā)癥模型，如糖尿病腎病模型、肝損害模型等，但由于其對飼養(yǎng)條件的要求較高，在實驗研究中的應用有一定局限性[15]。GK鼠類糖尿病動物模型具有穩(wěn)定的葡萄糖耐受和胰島素抵抗，適用于構建非肥胖糖尿病動物模型，相比于高脂飲食聯(lián)合STZ誘導建立的糖尿病動物模型來說，GK大鼠模型具有更好的遺傳穩(wěn)定性，更適合應用于Ⅱ型糖尿病發(fā)病機制的研究[16]?？偟膩碚f，在關于糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的研究中，db/db小鼠、ob/ob小鼠糖尿病模型是較常見的動物模型。但由于自發(fā)性糖尿病動物模型的價格昂貴且不易獲得、對飼養(yǎng)條件要求過高，故而較少應用于科研實驗中。

1.4 基因工程動物模型 基因工程動物模型(基因敲除糖尿病動物模型)是運用DNA靶向修飾技術，通過基因敲除或修飾改變相關糖代謝基因的表達，導致糖代謝紊亂，從而建立相關動物模型，如相關位點胰島素受體底物1、2基因的敲除。除此之外，還可以通過敲除相關基因，如Unc13基因、PDHA1基因等，建立糖尿病動物模型并應用于糖尿病疾病及相關并發(fā)癥的實驗研究中[17-18]。但轉基因工程技術的操作和制備難度較大，價格昂貴且不易獲取，因而在一般的實驗研究中難以廣泛開展應用。

2 模擬病理因素的糖尿病性潰瘍動物模型及其分類

實驗性糖尿病動物從患病到形成潰瘍所需時間較長，因此，一般采用人為模擬病理因素的方法來建立糖尿病性潰瘍模型，主要分為缺血性動物潰瘍模型、神經病變性動物潰瘍模型、感染性動物潰瘍模型。

2.1 缺血性動物潰瘍模型

2.1.1 血管結扎法：下肢血管病變缺血是導致糖尿病足潰瘍的重要原因之一，基于此機制可以采用下肢血管結扎、離斷血管的方法建立下肢缺血性潰瘍模型。有學者采用腹腔注射STZ誘導糖尿病小鼠模型后，采用高位結扎股動脈、股靜脈并斷離股動脈的方法建立下肢缺血模型，并結合激光多普勒成像儀監(jiān)測血流變化，結果顯示，該方法建立的糖尿病潰瘍模型可進行定量分析，可信度高[19]。但該模型通過下肢血管高位結扎和/或離斷下肢血管形成的急性缺血壞死病理改變，可能與臨床上由糖尿病引起的中、小及微血管慢性缺血病變導致的糖尿病性潰瘍有較大差異。高懷林等[20]采用高脂飲食+STZ誘導糖尿病大鼠后，對大鼠股動脈及股靜脈進行離斷，成功建立糖尿病足模型，并將其用于糖尿病足大鼠血管內皮功能研究中。但此模型通過離斷股動脈及股靜脈建立的糖尿病足病變，與臨床上糖尿病患者由于長期高血糖狀態(tài)導致血管病變甚至缺血，或同時伴有側支血管損傷的病理有一定差異。

2.1.2 皮膚壓迫法：有學者先腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠模型后，再利用磁片磁鐵相互吸引壓迫的方法誘導局部組織皮膚缺血-再灌注損傷而形成糖尿病大鼠潰瘍模型(將磁片植入大鼠背部，再通過外部磁鐵相互吸引產生壓力，從而造成皮膚局部缺血)，但由于實驗過程未進行實時、客觀地監(jiān)測血流，無法直接說明壓迫部位缺血-再灌注的過程；并且單一皮膚壓迫法誘導缺血形成的潰瘍與長期糖尿病導致的慢性缺血病理改變存在很大的差異[21-23]。

2.2 神經性病變動物模型 屈璐等[24]采用高脂飲食+STZ誘導SD大鼠糖尿病模型后，沿大鼠坐骨神經解剖位置放置干凍袋，12周后檢測大鼠坐骨神經動作電位傳導速度并觀察坐骨神經病理形態(tài)學，如出現(xiàn)坐骨神經功能減退及病理形態(tài)改變即認為糖尿病周圍神經病變的大鼠模型構建成功。但在科研實驗中，較少單獨建立動物神經性病變潰瘍模型。

2.3 感染性動物模型 感染是糖尿病性潰瘍常見的并發(fā)癥之一。在感染致病菌中，革蘭陰性菌和革蘭陽性菌所占比例均等，但常見單菌致病菌為金黃色葡萄球菌[25]。目前糖尿病感染性動物模型的建立一般都采用皮下菌株注射。有學者采用STZ+高脂飲食誘導建立大鼠糖尿病模型后，使用恒溫恒壓燙傷儀燙傷大鼠背部下端皮膚(參數(shù)：溫度90℃，壓力9.8 N，探頭4 cm2，接觸時間10 s)，同時皮下注射質控菌株以形成潰瘍感染，構建多因素誘導的糖尿病性潰瘍模型，結果顯示該模型可更為真實地模擬臨床上糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的發(fā)病機制及多因素下創(chuàng)面潰瘍感染的疾病特征[26-27]。

3 模擬臨床癥狀體征的糖尿病性潰瘍動物模型及其分類

模擬臨床癥狀體征的糖尿病性潰瘍動物模型主要分為皮膚全層切除模型、燙傷模型等。

3.1 皮膚全層切除模型 腹腔注射STZ誘導糖尿病動物模型后，應用外科方法，用18 mm的圓形圖章在距肩胛骨水平下2 cm脊柱正中皮膚上(造模區(qū))印出標志，消毒后沿標志剪去全層皮膚(深至筋膜)，制備皮膚缺損創(chuàng)面[28-30]。此方法可操作性強、耗時短，潰瘍形態(tài)規(guī)則且面積可控，適合外用輔料及藥物，以及糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的相關研究。但該模型無法模擬糖尿病患者因長期高血糖狀況下導致機體血管、神經、免疫功能等方面發(fā)生病理改變從而引發(fā)潰瘍創(chuàng)面的過程；同時潰瘍創(chuàng)面持續(xù)時間較短，若進行長周期的糖尿病性潰瘍創(chuàng)面研究，可運用多因素聯(lián)合造模的方法來延長潰瘍持續(xù)時間，如聯(lián)合皮下菌株注射合并感染[31]。

3.2 燙傷模型 糖尿病周圍神經病變導致肢體末端感覺、溫度覺下降或缺失后，糖尿病患者對溫度感覺也隨之減弱，因此燙傷成為糖尿病性潰瘍的常見因素之一。有研究應用高脂飲食+腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠模型,并于4周后將大鼠股動脈及其分支結扎24 h，使用燙傷模具建造體表燙傷模型，病理結果顯示大鼠皮膚創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤，伴隨汗腺、毛囊等附件破壞，形成深Ⅱ度燙傷，該實驗應用血管結扎結合燙傷因素造模，更好地模擬了糖尿病性潰瘍創(chuàng)面形成的過程[32]。

4 總結與展望

高糖高脂飲食結合STZ誘導法是目前常用的糖尿病動物模型建模方法，皮膚全層切除法是常用的糖尿病性潰瘍動物模型建模方法。但這些方法仍存在以下問題：(1)對造模動物血糖的檢測標準、血糖檢測時間、STZ造模所用劑量等，目前尚無統(tǒng)一標準；(2)造模中急性缺血性壞死的病理改變與糖尿病潰瘍創(chuàng)面中的慢性缺血性病理改變有一定差異；(3)局部壓迫法中缺少可實時、客觀監(jiān)測的血流指標；(4)單獨模擬病理因素或單一模擬臨床癥狀體征，不能完全模擬多種致病機制，使得動物模型的病因癥狀及病理機制與臨床上的糖尿病性潰瘍仍存在較大差距。

單獨模擬病理因素或臨床癥狀體征建立糖尿病性潰瘍動物模型相對簡易、耗時較短，其中模擬病理因素的動物模型更符合糖尿病性潰瘍的發(fā)病機制[33]。但臨床上糖尿病性潰瘍主要是由血管損傷、神經病變所致，加上潰瘍創(chuàng)面容易反復感染,在實驗造模上很難完全模擬潰瘍創(chuàng)面發(fā)生的全過程。實驗研究中可以通過多因素聯(lián)合作用來制備糖尿病潰瘍動物模型，使造模動物的發(fā)病特點及病理機制等與臨床糖尿病性潰瘍創(chuàng)面更為接近。