鹽酸戊乙奎醚對腦梗死模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制▲

唐曉怡 譚紅保 趙 倩 李玉芳 吳 荻

(湖南省長沙市第四醫(yī)院麻醉科，長沙市 410000，電子郵箱：tdw489@163.com)

腦梗死主要由腦組織局部供血不足引起，腦組織缺血缺氧性壞死、神經(jīng)功能障礙是其典型的表現(xiàn)[1-2]。中老年人群為腦梗死高發(fā)群體，男性發(fā)病率相對較高，隨著我國人口老齡化現(xiàn)象加重，每年新增腦梗死病例數(shù)不斷上升，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注[3-4]。鹽酸戊乙奎醚是一種廣譜的抗膽堿藥物，能夠拮抗M1受體，減輕神經(jīng)元損傷[5-6]，將其應(yīng)用于腦血管疾病，鮮有研究報(bào)告。本研究通過建立腦梗死大鼠模型，使用鹽酸戊乙奎醚進(jìn)行干預(yù)，觀察其治療效果，旨在探究鹽酸戊乙奎醚對腦梗死模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 30只健康雄性SD大鼠，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[使用許可證號(hào)：SYXK(吉)2020-0004)]，鼠齡7～9(8.1±0.7)個(gè)月，體重227～252(239.6±9.8)g。在相對濕度50%～55%、溫度21℃～25℃的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。主要試劑：鹽酸戊乙奎醚(成都力思特制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20051948)；過氧化氫酶(catalase，CAT)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：HZ-E14940；SZ-HAS-285；EK-M29386；EK-R36902、EK-R36877)；兔抗大鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)抗體(HyClone公司，批號(hào)：A26388、A25267)；小鼠抗兔Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3β，MAP1LC3B)抗體(Dako公司，批號(hào)：D7751,D8652)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體(Gibco公司，批號(hào)：A1973、A2768)；山羊抗兔IgG(艾美捷科技有限公司，批號(hào)：H20190201)； TTC溶液(青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20200501)；4%多聚甲醛(上海歌凡生物科技有限公司，批號(hào)：20200731)；Western封閉液、Western洗滌液(上海威奧生物科技有限公司，批號(hào)：20200331；20200402)；酶標(biāo)分析儀(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號(hào)：ML-dr3518)。

1.2 建模及分組干預(yù) 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組和鹽酸戊乙奎醚組各10只。給予所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進(jìn)行麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，消毒頸部，將頸部正中部位皮膚剪開，顯微鏡下將頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分離暴露于術(shù)野，正常組隨后縫合傷口，作為假手術(shù)對照。于其他大鼠近心端結(jié)扎近端頸外動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎固定頸總動(dòng)脈，阻斷大鼠腦組織中動(dòng)脈，取下微動(dòng)脈夾，根部固定頸內(nèi)動(dòng)脈，再次進(jìn)行消毒處理后縫合傷口。建模過程中模型組大鼠死亡1只。建模成功24 h后正常組、模型組大鼠腹腔注射1 mL生理鹽水，鹽酸戊乙奎醚組大鼠腹腔注射鹽酸戊乙奎醚，劑量為2 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水后腹腔注射。所有大鼠均連續(xù)干預(yù)7 d，1次/d。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估：(1)自各組大鼠干預(yù)6 h后，對學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)估。準(zhǔn)備高50 cm、直徑150 cm圓形水池，水池中央有一高30 cm、直徑10 cm平臺(tái)，水池口標(biāo)記4個(gè)位點(diǎn)作為大鼠入水口(四點(diǎn)相連為正方形)，注入半池水，水溫27℃。分別于已4個(gè)位點(diǎn)將大鼠置入水中，記錄大鼠自入水點(diǎn)游至預(yù)置平臺(tái)時(shí)間，將120 s內(nèi)未游至平臺(tái)的大鼠引至平臺(tái)，記為120 s。大鼠在平臺(tái)上停留30 s之后，測試其他入水口，計(jì)算4個(gè)入口大鼠游至平臺(tái)的時(shí)間平均值，即大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間，每天1次，所有大鼠均連續(xù)測試5 d。逃避潛伏期時(shí)間越長，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越差。(2)對各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]。其中0分為行為學(xué)正常無障礙；1分為左前肢伸展異常；2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分為向一側(cè)傾倒；4分為喪失自主活動(dòng)能力，意識(shí)障礙。

1.3.2 腦組織含水量和梗死體積檢測、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色：(1)含水量測定。干預(yù)7 d后，各組大鼠分別取5只，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進(jìn)行麻醉后頸椎脫臼法處死，取大鼠腦組織，使用濾紙吸取大鼠腦組織表面水分，稱重得到腦組織的濕質(zhì)量，將腦組織置于95℃烤箱中烤至恒重，稱取干質(zhì)量，計(jì)算含水量，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。(2)梗死體積測定。對各組剩余大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進(jìn)行麻醉后頸椎脫臼法處死，取模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠缺血區(qū)腦組織及正常組大鼠腦組織，-30℃冰箱冷凍保存0.5 h，取出腦組織制作厚約10 μm的連續(xù)切片。每間隔3片取1片，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取各組腦組織切片,37℃環(huán)境中使用2% TTC溶液染色0.5 h，使用4%多聚甲醛固定6 h，拍照，使用經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)測定梗死面積，并以此對腦組織梗死體積進(jìn)行測算。(3)HE染色。取1.3.2(2)中各組大鼠腦組織切片，將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中脫水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡對各組大鼠腦組織細(xì)胞病理狀況進(jìn)行觀察。

1.3.3 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥指標(biāo)水平檢測：取1.3.2(2)中各組大鼠腦組織切片，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)CAT、ROS、8-OHdG及炎癥因子IL-6、IL-1β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 TLR4/NF-κB通路蛋白、自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測：免疫印跡法檢測腦組織中TLR4、NF-κB，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、MAP1LC3B，以及凋亡相關(guān)蛋白PI3K、mTOR的相對表達(dá)量，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后依據(jù)蛋白分子大小把凝膠切開并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,用Western封閉液在室溫下將待測蛋白和內(nèi)參蛋白封閉90 min,按1 ∶1 000稀釋待測蛋白抗體，內(nèi)參抗體以1 ∶2 000比例稀釋,孵育過夜4℃，使用Western洗滌液洗滌5次，每10 min 1次。加入稀釋山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),孵育60 min，室溫水平搖床,洗滌5次Western洗滌液,每10 min 1次。經(jīng)過ECL顯色和曝光后，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，使用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測條帶的灰度值,以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化 正常組大鼠腦組織細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核清晰，無病理變化。模型組大鼠腦組織細(xì)胞排列無規(guī)則，細(xì)胞核破裂，間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤情況嚴(yán)重。鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞腫脹、破裂以及炎性細(xì)胞浸潤的情況較輕。見圖1。

正常組 模型組 鹽酸戊乙奎醚組

2.2 各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短(均P<0.05)。與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期較長，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠逃避潛伏期較短，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較低(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的比較(x±s)

2.3 各組大鼠的腦組織梗死體積和含水量 鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織梗死體積小于模型組(P<0.05)。與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織含水量較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠腦組織含水量較低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠腦組織梗死體積和含水量的比較(x±s,%)

2.4 各組大鼠腦組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠CAT水平較低，ROS、8-OHdG水平較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠CAT水平較高，ROS、8-OHdG水平較低(均P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較(x±s)

2.5 各組大鼠腦組織中的TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)量及炎癥因子水平 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量及IL-6、IL-1β水平較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量及IL-6、IL-1β水平較低(均P<0.05)。見表4、圖2。

表4 3組大鼠腦組織中TLR4/NF-κB通路蛋白相對表達(dá)量及炎癥因子水平的比較(x±s)

圖2 各組TLR4/NF-κB通路蛋白的表達(dá)情況

2.6 各組大鼠腦組織中的自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組、鹽酸戊乙奎醚組大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相對表達(dá)量較高(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸戊乙奎醚組大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相對表達(dá)量較低(均P<0.05)。見表5和圖3。

表5 3組大鼠自噬和凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

A B C

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的腦組織缺血缺氧壞死性疾病，具有病情進(jìn)展快、致殘致死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者健康[8-9]。臨床上治療腦梗死的手段主要包括介入治療、溶栓治療等，但是目前尚無治療腦梗死的特效手段，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)一定程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，因此尋找一種有效的治療方法具有重要意義[10-11]。鹽酸戊乙奎醚作為一種M受體拮抗劑，可選擇性拮抗M1、M3受體，能夠抑制乙酰膽堿毒性，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。

腦水腫是腦梗死常見的病理改變，可損害神經(jīng)系統(tǒng)功能。本研究中，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)大片梗死病灶，鏡下可見腦組織細(xì)胞排列無規(guī)則，細(xì)胞核破裂，間質(zhì)水腫，腦組織含水量增加，符合腦梗死的病理改變。有研究顯示，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展不僅可造成機(jī)體神經(jīng)功能的損害，還會(huì)對患者的認(rèn)知功能造成一定的影響[12-13]。本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，腦梗死大鼠的逃避潛伏期較延長，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)，提示腦梗死大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)功能損害。而使用鹽酸戊乙奎醚干預(yù)后，腦梗死大鼠的腦梗死體積減小，腦組織含水量下降，逃避潛伏期縮短，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)，說明鹽酸戊乙奎醚具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，不僅可縮小腦梗死大鼠的梗死灶、減輕腦水腫，還可改善大鼠的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能。

大量臨床研究表示，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展伴隨著腦組織氧化應(yīng)激損傷[14-15]。CAT是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要酶類清除劑，能夠清除過氧化氫，減輕細(xì)胞損傷。腦梗死的發(fā)生和發(fā)展過程中有ROS大量生成，致使腦組織神經(jīng)元損傷，而ROS具有一定氧化性，故氧化產(chǎn)物8-OHdG也隨之大量生成。本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠CAT水平較低，ROS、8-OHdG水平較高，而使用鹽酸戊乙奎醚干預(yù)后腦梗死大鼠CAT水平升高，ROS、8-OHdG水平降低，說明鹽酸戊乙奎醚干預(yù)能夠減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

腦梗死的嚴(yán)重程度與炎癥反應(yīng)水平有著密切聯(lián)系[16-17]。TLR4/NF-κB通路與機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)[18-19]：TLR4在腦組織血管細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)腦組織出現(xiàn)血氧不足時(shí)，腦血管通透性增加，TLR4釋放至血液中，從而參與炎癥反應(yīng)。IL-6、IL-1β為TLR4/NF-κB通路下游炎癥因子，也與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量及IL-6、IL-1β水平較高，使用鹽酸戊乙奎醚干預(yù)后腦梗死大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎癥因子表達(dá)水平下調(diào)，說明使用鹽酸戊乙奎醚干預(yù)能夠抑制腦梗死大鼠腦組織炎癥反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)作用。

此外，腦梗死的發(fā)生和發(fā)展還伴隨著腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬、凋亡[20-21]。Beclin-1、MAP1LC3B是評(píng)價(jià)細(xì)胞自噬情況的常用指標(biāo)，二者表達(dá)變化與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。PI3K、mTOR為PI3K/蛋白激酶B信號(hào)通路的相關(guān)蛋白，二者表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠腦組織Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR蛋白的表達(dá)量均較高，而使用鹽酸戊乙奎醚干預(yù)的腦梗死大鼠上述蛋白的表達(dá)量降低，說明鹽酸戊乙奎醚干預(yù)能夠調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、MAP1LC3B及細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白PI3K、mTOR的表達(dá)，從而抑制腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬、凋亡，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，鹽酸戊乙奎醚不僅可縮小腦梗死大鼠的腦梗死體積、減輕腦水腫，還可改善大鼠的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能。該藥物的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)控TLR4/NF-κB通路及下游炎癥因子以減輕腦組織炎癥反應(yīng)，以及調(diào)控相關(guān)蛋白以抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡有關(guān)。