碳纖維-納米金復(fù)合材料修飾電極檢測ATP的研究

張思月，邵 波，謝 慧，胡亞晨，張冰雪，張曉萍，孫 偉

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南省激光技術(shù)與光電功能材料重點(diǎn)實驗室，?？谑泄δ懿牧吓c光電化學(xué)重點(diǎn)實驗室，海南 ?？?571158）

三磷酸腺苷（ATP）是黃嘌呤核苷酸用生物發(fā)酵的方法制備而成的化合物，是體內(nèi)組織細(xì)胞所有生命活動的直接能量來源，被稱為細(xì)胞內(nèi)能量的“分子貨幣”。ATP作為生物的重要指標(biāo)量被廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)和微生物學(xué)測定[1]、食品質(zhì)量控制和環(huán)境分析等。目前，檢測ATP含量的方法主要有高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法、光學(xué)分析法、生物發(fā)光法[3-4]及電化學(xué)方法[5-7]。而電化學(xué)方法由于靈敏度高、儀器簡單等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注。

納米金制備方法簡單，穩(wěn)定性好，催化活性強(qiáng)，生物相容性好[8-10]，可高效吸附蛋白質(zhì)且不影響被吸附蛋白質(zhì)的生物活性，常常被用作探針對細(xì)胞內(nèi)外的蛋白質(zhì)、多肽鏈、多糖等生物體內(nèi)常見大分子進(jìn)行精確的定位。納米金的電催化活性與其形態(tài)、粒徑和分散度緊密相關(guān)。為了提高其電化學(xué)性能，通常利用其他載體（如納米碳材料、石墨烯和金屬氧化物）負(fù)載。納米碳纖維（CNF）一般呈纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有大的比表面積，可為納米金粒子提供巨大的附著位點(diǎn)。目前CNF常用的制備方法有化學(xué)氣相沉積法、電弧法、激光燒蝕法和前驅(qū)體法等[11]，而靜電紡絲法與其他方法相比，因其原理簡單，可操作性強(qiáng)，成本低，成為制備CNF最有前途的方法之一[12-14]。

本文采用靜電紡絲法、高溫碳化法和水熱合成法制備了CNF-Au/CILE 電極，在最優(yōu)實驗條件下將該修飾電極用于ATP的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP濃度為0.06～0.80 mmol/L和12.0～150.0 mmol/L時，氧化峰電流值與濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測限為0.023 mmol/L。該電極具有良好的選擇性和穩(wěn)定性，并成功應(yīng)用于三磷酸腺苷二鈉注射液中ATP含量的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI604E 電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；三電極系統(tǒng)：CNF-Au/CILE 為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極；JSM-7100F型掃描電子顯微鏡（SEM），日本JEOL公司。

石墨粉，上海華誼集團(tuán)華原化工有限公司膠體化工廠；N-己基吡啶六氟磷酸鹽，蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司；5-三磷酸腺苷二鈉，美國Kayon公司；0.2 mol/L B-R緩沖液，自制。所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 CNF-Au/CILE修飾電極的制備

采用水熱合成法制備CNF-Au，配制1.5 mg/mL的CNF-Au分散液，取10μL均勻涂布于碳離子液體電極（CILE）上，晾干后得到CNF-Au/CILE修飾電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 CNF-Au/CILE電極的表征

圖1是不同放大倍數(shù)下CNF-Au的SEM圖，碳纖維呈現(xiàn)相互交錯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，為金納米粒子提供了充足的附著位點(diǎn)，使更多的金納米粒子得以均勻地分布在碳纖維素表面。圖2（A）是CILE和CNF-Au/CILE在1.0 mmol/L K3[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的循環(huán)伏安曲線圖，在CNF-Au/CILE（曲線a）上的氧化還原峰電流相比于CILE（曲線b）的氧化還原峰電流明顯增大，這是由于CNF-Au的存在增大了K3[Fe(CN)6]的電子轉(zhuǎn)移速率，表明CNF-Au納米復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性。

圖1 不同放大倍數(shù)下CNF-Au的SEM圖Figure 1 SEM images of CNF-Au at different amplification multiples

圖2（B）采用循環(huán)伏安法研究了CNF-Au/CILE的氧化還原峰電流值與掃描速度（υ）的關(guān)系，如圖2（B）所示，在0.01～0.20 V/s 的掃速范圍內(nèi)，氧化還原峰電流與υ1/2呈線性關(guān)系，回歸方程為Ipc（μA）=112.68υ1/2-7.08（n=10，γ=0.998）和Ipa（μA）=-84.79υ1/2-2.30（n=10，γ=0.998）。CNF-Au/CILE的有效面積可由Ran?dles-Sevcik方程（Ip=2.69×105AD1/2n3/2υ1/2C）[15-16]求解，其中，n是電子的轉(zhuǎn)移數(shù)，A是電極的有效面積（cm2），D是鐵氰化鉀的擴(kuò)散系數(shù)（7.6×10-6cm2/s），C是鐵氰化鉀的濃度（1.0 mmol/L），υ是電位掃描速度（V/s），按此公式求出CNF-Au/CILE的有效面積為0.015 2 cm2。

圖2 （A）CILE和CNF-Au/CILE在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的循環(huán)伏安曲線圖（v=100 mV/s）；（B）CNF-Au/CILE在含有1.0 mmol/LK3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中不同掃速下的循環(huán)伏安圖（從a到i為0.01～0.20 V/s）Figure 2 (A)Cyclic voltammogram of CILE and CNF-Au/CILE in 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]and 0.1 mol/L KCl mixed solution(v=100 mV/s);(B)Cyclic voltammograms of CNF-Au/CILE at different scan rates(from a to i as 0.01～0.20 v/s)in 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]and 0.1 mol/L KCl mixed solution

2.2 ATP在CNF-Au/CILE上的電化學(xué)行為

圖3（A）為CNF-Au/CILE（曲線a）和CILE（曲線b）在pH=2.0的B-R緩沖液中的循環(huán)伏安曲線，圖3（B）為CNF-Au/CILE（曲線a）和CILE（曲線b）在含有1.0 mmol/L ATP、pH=2.0的B-R緩沖液中的循環(huán)伏安曲線。圖3（B）中曲線b的氧化峰電位Epa為1.511 V，峰電流Ipa為63.05μA；曲線a的氧化峰電位Epa為1.536 V，峰電流Ipa為138.89μA。由實驗數(shù)據(jù)可以看出，CNF-Au/CILE 的背景電流較CILE 大，說明納米材料的存在使界面電容電流的增加；ATP在CNF-Au/CILE 的氧化峰電流較CILE有較大提高，說明CNF-Au的存在有利于提高電化學(xué)信號。

圖3 （A）CILE（b）和CNF-Au/CILE（a）在pH=2.0 的B-R緩沖液中的循環(huán)伏安曲線;（B）1.0 mmol/L ATP在CILE（b）和CNF-Au/CILE（a）上的循環(huán)伏安曲線Figure 3 (A)Cyclic voltammograms of CNF-Au/CILE(a)and CILE(b)in blank B-R buffer solution with pH=2.0;(B)Cyclic voltammograms of 1.0 mmol/L ATP on CNF-Au/CILE(a)and CILE(b)

2.3 pH的影響

在pH 2.0～6.0的B-R 緩沖溶液中考察了pH值對ATP 電化學(xué)信號的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著pH值的增加，在CNF-Au/CILE上測得的ATP氧化峰電流逐漸減小，最大值出現(xiàn)在pH=2.0。在pH=2.0的B-R緩沖溶液中進(jìn)一步研究了ATP 的氧化峰電位與B-R 緩沖溶液pH 值的關(guān)系，線性回歸方程為Epa（V）=-0.052 pH+1.63（n=5，γ=0.998），斜率為-0.052 V/pH，與理論值-0.059 V/pH 相接近?？疾炝烁患娢缓透患瘯r間與ATP氧化峰電流值的關(guān)系。實驗結(jié)果得出富集電位的值取+0.3 V、富集時間的值取80 s時ATP的氧化峰電流值達(dá)到最大值。因此，本實驗均在富集電位為+0.3 V、富集時間為80 s條件下進(jìn)行。

圖4 1.0 mmol/L ATP在不同pH的B-R緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線Figure 4 Cyclic voltammograms of 1.0 mmol/L ATP in B-R buffer solution with different pH values

2.4 工作曲線

對不同濃度的ATP溶液分別進(jìn)行DPV掃描，結(jié)果如圖5所示，隨著ATP濃度的增大，DPV氧化峰電流Ipa也逐漸增大。在ATP 濃度為0.06～0.80 mmol/L 時，氧化峰電流Ipa與ATP 濃度呈線性關(guān)系（圖6-A），線性回歸方程為Ipa（μA）=0.019 67C（μmol/L）+1.132（n=7，γ=0.988）；在ATP濃度為12.0～150.0 mmol/L時，氧化峰電流Ipa與ATP 濃度呈線性關(guān)系（圖6-B），線性回歸方程為Ipa（μA）=0.450C（mmol/L）+12.889（n=8，γ=0.997），檢測限為0.023 mmol/L。

圖5 CNF-Au/CILE隨著不同濃度ATP加入后的DPV疊加圖Figure 5 Differential pulse voltammograms of CNF-Au/CILE with different concentration of ATP

圖6 氧化峰電流與ATP濃度的線性關(guān)系Figure 6 The linear relationship between Ipa and the.concentration of ATP

2.5 干擾測定

考察了一系列常見干擾物質(zhì)（L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-天冬酸、Ba2+、Ca2+、K+）對ATP測定的影響，實驗結(jié)果如表1所示。常見的共存干擾物質(zhì)對ATP測定的影響都不大，說明CNF-Au/CILE測定ATP具有一定的抗干擾能力。

表1 共存物對0.5 mmol/L ATP測定的影響Table 1 Effects of coexisting substances on determination of 0.5 mmol/L ATP

2.6 分析應(yīng)用

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了樣品的含量、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。由表2可知，實際檢測取得了良好的效果。

表2 三磷酸腺苷二鈉注射液樣品的測定結(jié)果（n = 3）Table 2 Determination of adenosine triphosphate disodium injection sample（n = 3）

3 結(jié)論

以金納米粒子為電催化活性劑，納米碳纖維為載體，采用水熱合成法制備碳纖維-金復(fù)合材料，將最優(yōu)濃度的碳纖維-金復(fù)合材料分散液滴涂于碳離子液體電極的表面，自然晾干后制得了碳纖維-金修飾電極（CNF-Au/CILE），計算得到有效面積為1.52×10-2cm2。采用CNF-Au/CILE 做了ATP的電化學(xué)測試，在最優(yōu)實驗條件（碳纖維-金復(fù)合材料分散液濃度為1.5 mg/mL，B-R富集時間為80 s，富集電位為+0.3 V，緩沖溶液的pH=2）下，ATP濃度為0.06～0.80 mmol/L和12.0～150.0 mmol/L時，氧化峰電流值與濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，ATP的檢測限為0.023 mmol/L。一系列常見干擾物質(zhì)對ATP測定的影響較小，將該實驗方法應(yīng)用于三磷酸腺苷二鈉注射液中ATP含量的測定取得了良好的效果。