1 株野生平菇菌株的鑒定及交配型分析

劉曉雪，王春霞，劉利娟，郭金英，鄭素月

（河北工程大學 園林與生態(tài)工程學院，河北 邯鄲056038）

平菇（Pleurotus ostreatus）食味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有極高的食藥用價值，特別是其富含的黃酮類、有機酸、幾丁質(zhì)等多種活性成分可以有效抑制癌細胞生長，增強人體免疫力[1-2]。近年來隨著人們對飲食健康越來越重視，對平菇的需求與日劇增。同時，作為適應性較強的側耳屬木腐真菌[3]，平菇的栽培范圍遍及全球各大洲，我國是平菇栽培大國，據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2019 年我國平菇產(chǎn)量686.47萬t，為我國栽培量僅次于香菇和黑木耳的第三大食用菌品種[4]。

目前我國的食用菌基本實現(xiàn)人工種植，其栽培技術已非常成熟，但是在實際生產(chǎn)過程中經(jīng)常因為菌株交配型無法準確鑒定，而導致產(chǎn)生親和率下降、產(chǎn)量不穩(wěn)定、經(jīng)濟效益下滑等問題[5-7]，給食用菌產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，因此菌株交配型的鑒定尤為重要[8]。平菇是擔子菌中標準的四極性異宗結合菌[9]，其交配型系統(tǒng)研究最早開始于20 世紀20 年代[10]，研究者對交配型做了大量工作。季哲等[11]以2個黃傘子實體為材料，用孢子稀釋法分離孢子，經(jīng)3輪雜交后，鑒定出黃傘為四極性異宗配合的擔子菌。余梅等[12]采用原生質(zhì)體單核化和單孢分離的方法發(fā)現(xiàn)，真姬菇為四極性異宗結合擔子菌。楊軍等[13]通過核遷移試驗鑒定出灰樹花屬于四極性交配系統(tǒng)。馮偉林等[14]鑒定出杏鮑菇屬于四極性異宗配合系統(tǒng)，并且應用ISSR 分子標記技術對獲取的4 種不同交配型的單核體進行DNA 指紋分析，認為ISSR 分子標記技術可以作為食用菌單核菌株鑒別及指紋分析的有效工具?？卤箝诺萚15]以赤芝JC 和AL 菌株為試驗對象，在常規(guī)交配型測定的基礎上，采用OWE-SOJ 技術對其單核菌株交配類型進行測定，確定了赤芝為四極性異宗結合菌。程莉等[16]采用標準測交法鑒定糙皮側耳的交配型系統(tǒng)為四極性異宗配合真菌。單核菌株作為重要的育種材料[17-18]，對交配系統(tǒng)的分析至關重要。交配系統(tǒng)以及交配行為的研究不僅僅是雜交育種工作的基礎，也是從交配型因子的角度理解和評價菌株資源遺傳多樣性的基礎。交配型涉及親和雜交、雙核菌絲體構建和子實體發(fā)育等重要生理過程，是值得深入研究的一個課題[19]。對側耳屬菌株的研究雖然已經(jīng)獲得了部分菌株的基因組序列，但是食用菌交配型位點和基因的研究仍舊存在很多空白，還沒有從全基因組的水平對這些物種的交配型位點和交配型基因進行深入研究[20]。并且目前關于野生側耳屬菌種的鑒定及交配型分析更是鮮見報道。為此，在ITS鑒定的基礎上，通過單孢分離法對1株野生側耳屬平菇菌株進行孢子單核菌株分離，經(jīng)過3 輪雜交和核遷移試驗，對該平菇菌株的4 種交配型進行鑒定，為今后從交配型因子的角度深入研究側耳屬平菇的遺傳規(guī)律及擴充種質(zhì)資源庫等工作奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生平菇子實體采集于河北工程大學原中華南校區(qū)一棵龍爪槐樹干上，由河北工程大學食用菌研究室分離、鑒定和保藏，菌株編號為Po15。

1.2 方法

1.2.1 ITS 鑒定 采用DNA 試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取菌絲體DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3′）進行擴增。PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行克隆測序。將得到的菌株ITS 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，利用ClustalX 軟件對所得序列進行校正和比對分析，采用MEGA 6.0 軟件以Neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 單孢分離方法 采集平菇子實體進行多孢分離和單孢分離，具體方法參考文獻[21]。

1.2.3 交配型測定方法 單核菌株交配型常規(guī)測定參照張樹庭等[22]方法，測定程序如表1所示。

表1 四極性交配型測定程序Tab.1 Procedure for determination of tetrapolar mating type

1.2.4 核遷移試驗 參考程莉等[16]、李安政等[23]方法，采用核遷移試驗對該平菇的交配型進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 ITS鑒定和分析

利用ITS1 和ITS4 通用引物對野生菌株進行擴增、測序后，將測序結果進行BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)目標序列與登錄號為LC149608.1 的平菇菌株同源性達到99.71%。并通過構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖1），該野生菌種與Pleurotus pulmonarius（肺形側耳）、Pleurotus floridanus（佛州側耳）具有一定的遺傳距離，而與Pleurotus ostreatus（MT778826、MT778816、MT778817）3 個平菇菌種相似性達到100%。因此，結合形態(tài)學可確定分離菌株為糙皮側耳。

2.2 單核菌株群體的獲得

根據(jù)單孢分離法，挑取了100個菌株，經(jīng)顯微觀察和生長速度測定，剔除有鎖狀聯(lián)合及長速較差菌株，最終獲得69株可用的孢子單核菌株。對其生長速度、菌落形態(tài)等生物學指標進行測定，結果表明，69 株單核菌株的菌落形態(tài)主要分為4 類（圖2），與程爽爽等[25]在香菇單核菌絲研究中的結果一致。4種類型包含的菌株見表2。

表2 糙皮側耳單核菌株的菌落形態(tài)分類結果Tab.2 Classification results of monokaryon strains from Pleurotus ostreatus by colony types

2.3 交配型鑒定結果

根據(jù)四級性交配型測定程序?qū)@取的69 株單核菌株進行交配型鑒定。首先將P1 菌株假設為T1（AxBx）進行68組配對試驗，與T1親和的有37株，其交配型為AyBy；第2 次試驗將從第1 輪親和菌株中挑選P8 菌株為T2（AyBy），進行31 組配對試驗，與T2親和的有19 株，其交配型為AxBx；第3 次試驗從剩余的既不與T1親和也不與T2親和的菌株中挑選P10菌株為T3（AxBy），進行11 組配對試驗，與T3親和的有3 株，其交配型為AyBx，不親和的有8 株，其交配型為AxBy。以此3 輪交配共進行110 組配對試驗，將69 株單核菌株分成4 類，結果如表3 所示。在進行配對試驗過程中，需將單核菌株中生長速率居中的菌株作為測交菌株T1、T2和T3，以防止試驗過程中出現(xiàn)一方長得過快或過慢而影響配對試驗結果。

表3 糙皮側耳單核菌株3輪配對結果統(tǒng)計Tab.3 Statistical results of three rounds of pairing of monokaryon strains from Pleurotus ostreatus

2.4 核遷移試驗鑒定結果

根據(jù)3 輪交配結果，從T1（AxBx）、T2（AyBy）、T3（AxBy）、T4（AyBx）4 個類型中分別抽取生長速度一致的單核菌株P16、P8、P14、P17 做核遷移試驗，流程如圖3所示。

由于A 因子控制的是菌絲的融合，B 因子控制核的遷移，所以在一種非標準型四極性的不親和反應中，想知道哪一種是A=B≠，哪一種是A≠B=，哪一種是A=B=，就必須進行核遷移等補充試驗。結果表明，因P8×P16 為可親和菌株，所以P8 與P16 為A≠B≠，則P8（T2）的交配型為A2B2；P8×P14 未發(fā)生細胞核的遷移，所以P8 與P14 為A≠B=，則P14（T3）的交配型為A1B2；而P8×P17 發(fā)生了細胞核的遷移，所以P8 與P17 為A=B≠，則P17（T4）的交配型為A2B1。野生菌株孢子單核體的4 種交配型得到鑒定，如表4所示，說明該野生平菇為四極性異宗結合真菌。

表4 糙皮側耳單核菌株交配型測定結果Tab.4 Determination of mating type of monokaryons strains of Pleurotus ostreatus

2.5 交配型比例χ2檢驗結果

交配型鑒定結果顯示，采收的野生平菇經(jīng)單孢分離后，其交配型出現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象。在獲取的69株單核菌株中，T1、T2、T3、T44 種交配型的比例為20∶37∶9∶3，通過計算得知χ2=39.35。檢測結果顯示，實際測得的交配型比例與預期的1∶1∶1∶1 的比例不相符。

3 結論與討論

交配型的鑒定一般采用的是單孢分離或原生質(zhì)體單核化等方式獲得單核菌株，再根據(jù)標準測交法及核遷移試驗對菌種進行鑒定[11-16]。本試驗在ITS 鑒定的基礎上，通過以上方法對野生平菇的69株單核菌株進行交配型鑒定，結果表明，該野生平菇為四極性異宗結合的糙皮側耳。

在69 株單核菌株的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)大致分成了4 種類型，該結果與對香菇[25]、靈芝[26]等研究結果一致。造成菌絲形態(tài)、菌落特征的差異可能與其交配的A、B 控制因子有關，因為在交配型鑒定的常規(guī)程序中，同樣也會根據(jù)菌落交接處的菌落形態(tài)來確定其交配類型。但是本試驗中4種交配類型與菌落形態(tài)分類并不一致，因此是否可以根據(jù)菌落的形態(tài)來初步確定其交配型，或者說菌落類型與交配型之間是否有一定的關系還有待研究。

本試驗中獲得的T1、T2、T3、T44種交配型的比例與孟德爾的分離規(guī)律1∶1∶1∶1 不符，實際比例出現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象。林芳燦等[24]對香菇研究發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體單核體的交配型比例同樣出現(xiàn)嚴重的偏分離，且2種交配型的比例相差可達43∶1。朱朝輝等[27]以香菇為例研究了交配型與單核體再生能力之間的關系，結果顯示，不同交配型單核體的再生能力是有差異的，造成比例出現(xiàn)偏差可能與某種交配型的單核體再生能力弱有關。程水明[28]同樣以香菇為試材，發(fā)現(xiàn)來自同一雙核菌株F1擔孢子的菌絲萌發(fā)能力和生長速度是有差異的，這種差異導致了4種交配型分布不均衡，從而造成偏分離現(xiàn)象的發(fā)生。本研究中，來自同一野生平菇菌株的69株孢子單核體在菌絲培養(yǎng)階段，同樣出現(xiàn)了菌落形態(tài)、菌絲生長速度及萌發(fā)能力的差異，而這些現(xiàn)象均有可能導致偏分離現(xiàn)象的發(fā)生。