長鏈非編碼RNA SPATA3-AS1在胃癌中的表達及意義

張鶴騰，唐銀炳，謝文杰，陸佳偉，汪貝貝，侯雯躋，周曉東，蔣鵬程，于強，張文波，鄒晨

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；3. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院神經外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

胃癌死亡率高，是癌癥相關死亡的第三大常見原因[1]。據(jù)國際癌癥研究機構編制的2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率估算數(shù)據(jù)統(tǒng)計，胃癌發(fā)病率為5.7%，死亡率為8.2%[2]。在我國，胃癌已成為男性第二大(13.5%)常見癌癥及第三大(15.1%)癌癥相關死亡原因、女性第五大(7.1%)常見癌癥及第二大(11.1%)癌癥相關死亡原因[3-4]。通常早期胃癌無明顯癥狀，約80%患者在確診時已處于進展期，早期診斷及治療可以提高50%～70%患者5年生存率[5-6]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類由不同種類的RNA分子組成的不編碼或翻譯任何蛋白質的長度大于200個核苷酸的功能性RNA分子，在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平均發(fā)揮重要的基因調控作用[7]。多種腫瘤的生物學行為與LncRNA功能失調密切相關[8-9]，如LncRNA ELFN1-AS1促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲[10]；LincRNA-ROR/miR-145軸通過靶向ZEB2誘導上皮-間充質轉化(EMT)，促進肝癌的侵襲和轉移[11]；LncRNA 91H通過與IGF2BP2相互作用調控IGF2表達，促進結直腸癌發(fā)生[12]；在胃癌中LncRNA LOC400043通過調節(jié)Wnt信號通路抑制胃癌進展[13]；LncRNA-ATB[14]、LncRNA HEIH[15]、LncRNA PVT1[16]均在胃癌中表達上調并參與促進胃癌細胞的增殖、遷移、凋亡等；LncRNA AL139147．1在胃癌中呈高表達可促進胃癌細胞增殖[17]；LncRNA HIF-1α和ANRIL在胃癌組織和患者血漿中均高表達[18]。

LncRNA SPATA3-AS1是人精子發(fā)生相關基因SPATA3的反義RNA，定位于染色體2q37.1，長度為3 526 bp。本課題組通過預實驗發(fā)現(xiàn)SPATA3-AS1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。為進一步研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究對80例胃癌及癌旁組織和29例胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的表達進行qRT-PCR檢測，隨后行細胞實驗研究SPATA3-AS1對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響和潛在機制。

1 病例和方法

1.1 研究對象

選擇2016年4月至2020年6月期間就診于江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科行胃癌根治術80例患者切除的癌組織與癌旁組織。術后病理檢查確診胃腺癌診斷，選取距腫瘤最遠邊緣>5 cm的胃組織為對照的癌旁組織。其中，男57例，女23例；年齡47～82歲，中位年齡67歲；腫瘤直徑≤5 cm者51例，>5 cm者29例；腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期40例；淋巴結轉移陰性40例，陽性40例。隨機收集上述29例患者清晨空腹肘正中靜脈血各5 mL，2 000 r/min室溫離心，取500 μL上層血漿于-80 ℃保存?zhèn)溆?。另選擇同期隨機選取的29例健康體檢者血漿。男23例，女6例；年齡47～77歲，中位年齡63歲；腫瘤直徑≤5 cm者14例，>5 cm者15例；Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期19例；淋巴結轉移陰性10例，陽性19例，本研究通過江蘇大學附屬人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒(海翊圣生物科技有限公司)；FITC-Annexin V 及細胞凋亡試劑盒(上海通善生物技術有限公司)；Transwell細胞遷移板(美國Corning公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Thermo Fisher公司)；人胃癌AGS、HGC-27細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；RNA提取試劑盒、Trizol均購自上海一基實業(yè)有限公司。

1.3 qRT-PCR檢測SPATA3-AS1相對表達量

按制Trizol試劑說明書，提取標本、細胞及血漿中總RNA，檢測RNA濃度及純度，參照RNA逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系。20 μL PCR反應體系：DEPC水8.2 μL、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL和各0.4 μL上、下游引物、cDNA 1 μL。每個樣本設3個復孔，SPATA3-AS1引物系列：上游為5′-CTTAAGGGGTCGCCTGAGTC-3′，下游為5′-GGCAGAAA GAAGCTGCCCTA-3′，以β-肌動蛋白作為組織和細胞的內參基因，以U6作為血漿樣本的內參基因，以-ΔCt值、-ΔΔCt值法計算相對表達量；qRT-PCR條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃退火30 s，40個循環(huán)。

1.4 細胞實驗

1.4.1 細胞轉染及分組 細胞分為si-SPATA3-AS1組及si-NC組。分別在12孔板中接種處于對數(shù)生長期的AGS、HGC-27細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度達60%～80%時行轉染。按說明使用Lipofectamine 2000試劑對AGS及HGC-27胃癌細胞進行轉染，每孔加入上述混合液100 μL及1 mL培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)48～72 h后回收。si-SPATA3-AS1序列為GCUGCUGGAACUGAAUAAATT，si-NC序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.4.2 繪制細胞生長曲線、克隆形成實驗檢測胃癌細胞增殖水平 繪制細胞生長曲線：取“1.4.1”轉染48 h的AGS、HGC-27細胞，胰蛋白酶消化并計數(shù)，每組6個復孔，以1×104/孔濃度接種。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h更換一次培養(yǎng)基，光學顯微鏡下每天計數(shù)1次取平均值。連續(xù)計數(shù)5 d后進行細胞生長曲線的繪制。細胞克隆形成實驗：取“1.4.1”轉染48 h的AGS、HGC-27細胞，胰蛋白酶消化，于6孔板中按103個/孔細胞數(shù)接種并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞增殖情況。培養(yǎng)約10 d后出現(xiàn)肉眼可見的細胞集落時，用0.5%結晶紫染色15 min并拍照及計數(shù)。

1.4.3 Transwell實驗檢測AGS、HGC-27細胞遷移與侵襲 細胞遷移實驗：取“1.4.1”轉染48 h的AGS、HGC-27細胞，調整細胞濃度約為1×105/mL。在Transwell 小室，上室每孔接種細胞數(shù)為2×104個，并在各對應下室中每孔加入等量含血清培養(yǎng)基，孵育24 h；棉簽擦去上室未遷移細胞，細胞用0.5%結晶紫染色15 min并拍照。細胞侵襲實驗：將無血清培養(yǎng)基與Matrigel按7 ∶1比例混合稀釋；用基質膠以50 μL/孔包被Transwell小室底部膜的上室面后放置于24孔板中，培養(yǎng)箱孵育2 h；余步驟同遷移實驗。

1.4.4 流式細胞凋亡實驗檢測胃癌細胞凋亡水平 取“1.4.1”轉染48 h后細胞并重懸，調整細胞密度為2×105/mL，加入FITC-Annexin V和Propidium iodide試劑，暗箱靜置15 min，流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡數(shù)。

1.4.5 qRT-PCR檢測敲減SPATA3-AS1后腫瘤相關mRNA表達 按制Trizol試劑說明書，取“1.4.1”轉染胃癌細胞，分別提取RNA后逆轉錄成cDNA，其余步驟同“1.3”。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，每個樣本設3個復孔，引物序列見表1。

表1 腫瘤相關基因引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SPATA3-AS1在胃癌組織中表達及與臨床病理特征分析

qRT-PCR結果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中SPATA3-AS1相對表達量明顯上調(t=2.183，P<0.05)。見圖1。根據(jù)胃癌組織中qRT-PCR檢測結果，取SPATA3-AS1相對表達量的中位數(shù)為分界值，將胃癌組織分為SPATA3-AS1高表達組(n=40)和低表達組(n=40)。胃癌組織中SPATA3-AS1相對表達與胃癌患者淋巴結轉移(P=0.007)、TNM分期 (P=0.007)及腫瘤浸潤深度(P=0.043)相關，而與其他因素無關(P均>0.05)。見表2。Kaplan-Meier分析顯示，與低表達組相比，SPATA3-AS1高表達組患者5年生存率明顯降低(HR=2.292，95%CI：1.143～4.597，P=0.020)。見圖2。

2.2 SPATA3-AS1在血漿中的表達與臨床意義

與健康體檢者相比，胃癌患者血漿中SPATA3-AS1表達水平顯著增高(t=4.156，P<0.05)。見圖3。SPATA3-AS1表達與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移相關(P均<0.05)，高表達者具有較多的淋巴結轉移及較高的腫瘤TNM分期。見圖4。此外，利用ROC曲線評估SPATA3-AS1在血漿中差異表達的敏感性及特異性，其曲線下面積為0.788，提示該指標具有較好的診斷價值。見圖5。

圖1 胃癌及癌旁組織中SPATA3-AS1表達水平比較

表2 胃癌患者癌組織中SPATA3-AS1的表達與臨床病理特征的關系

圖2 SPATA3-AS1表達水平與胃癌患者生存率的相關性

圖3 胃癌患者與健康者血漿中SPATA3-AS1相對表達水平比較(n=29)

圖4 胃癌患者血漿SPATA3-AS1表達與臨床病理特征的關系

圖5 胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的ROC曲線

2.3 敲減SPATA3-AS1對細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

2.3.1 敲減SPATA3-AS1對細胞增殖的影響 qRT-PCR結果顯示，與si-NC組相比，AGS、HGC-27細胞si-SPATA3-AS1組中SPATA3-AS1表達明顯降低(P均<0.01)，證實敲減效果滿意。見圖6。細胞生長曲線結果顯示，與si-NC 組相比，AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組胃癌細胞數(shù)分別從第3天及第4天明顯減少。見圖7。計數(shù)及克隆形成實驗顯示，與si-NC 組相比，AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞克隆形成率明顯降低(P均<0.01)，由此表明，敲減SPATA3-AS1抑制AGS、HGC-27細胞增殖。見圖8。

2.3.2 敲減SPATA3-AS1對細胞遷移的影響 Transwell實驗顯示，與si-NC對照組相比，AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞遷移能力均顯著降低(t=10.21，11.08，P均<0.01)。見圖9。

2.3.3 敲減SPATA3-AS1對細胞侵襲的影響 Transwell實驗顯示，與si-NC對照組相比，AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞侵襲能力顯著降低(t=12.88，10.30，P均<0.01)。見圖10。

圖6 qRT-PCR檢測敲減SPATA3-AS1后 AGS、HGC-27細胞中SPATA3-AS1的表達

圖7 敲減SPATA3-AS1后AGS和HGC-27細胞的生長曲線

圖8 細胞平板克隆形成實驗檢測各組AGS和HGC-27細胞增殖

圖9 Transwell 實驗檢測AGS和HGC-27細胞遷移能力

圖10 Transwell實驗檢測AGS和HGC-27細胞侵襲能力

2.3.4 敲減SPATA3-AS1對細胞凋亡的影響 Transwell實驗顯示，與si-NC對照組相比，AGS、HGC-27細胞si-SPATA3-AS1組細胞凋亡能力均顯著升高(t=11.07，9.94，P均<0.01)。見圖11。

圖11 流式細胞儀檢測AGS和HGC-27細胞的凋亡

2.4 敲減SPATA3-AS1對腫瘤相關基因mRNA表達的影響

qRT-PCR結果顯示，在AGS、HGC-27細胞株中，與si-NC對照組相比，si-SPATA3-AS1組EMT相關標志物發(fā)生顯著改變，其中間質標志物N-cadmRNA顯著下調，同時上皮標志物E-cadmRNA 顯著上調，與此同時轉錄因子Twist1、SnailmRNA表達明顯降低(P<0.05或<0.01)，而其他相關基因mRNA表達無明顯差異。見圖12。由此提示，SPATA3-AS1可能通過EMT途徑調控胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織和健康者血漿，SPATA3-AS1在胃癌患者癌組織和血漿中的表達明顯上調，且與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移相關。其中，高表達SPATA3-AS1患者生存率低于低表達患者，提示SPATA3-AS1可能預測胃癌患者遠期生存率。此外，ROC曲線下面積為0.788，提示SPATA3-AS1作為胃癌診斷指標具有較高的價值。體外細胞實驗結果表明，相比于陰性對照組，敲減SPATA3-AS1處理后的胃癌細胞侵襲、遷移、增殖能力均降低但細胞凋亡增加，說明SPATA3-AS1促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。

a：P<0.01，b：P<0.05，與si-NC組相比

為進一步研究SPATA3-AS1 在胃癌細胞生物學表型中的調節(jié)作用，本研究對腫瘤相關基因進行篩查。qRT-PCR結果顯示，敲減SPATA3-AS1顯著抑制轉錄因子Twist1、SnailmRNA和間質標志物N-cadmRNA表達，同時促進上皮標志物E-cadmRNA表達，提示SPATA3-AS1可能通過EMT途徑促進胃癌細胞表型惡化。EMT是上皮細胞獲得間充質特征的過程，對胚胎發(fā)生、傷口愈合及降低癌細胞藥物敏感性方面至關重要[19]。EMT在多種惡性腫瘤形成過程中促進癌細胞的遷移、侵襲、轉移及其他惡性生物學行為。Twist1、Snail、Slug等轉錄因子及N-cad、波形蛋白、E-cad等EMT相關基因的顯著表達，反映腫瘤細胞活躍的運動能力[20]。LncRNA可通過多種途徑調控胃癌EMT過程，如染色質修飾[21]、轉錄調控[22]、調控mRNA[23]等。本實驗結果提示，SPATA3-AS1在胃癌細胞中可能通過上調Twist1、Snail、N-cad表達，下調E-cad表達，促進上皮源性細胞失去細胞極性，細胞黏附能力下降、遷移運動能力增強，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和遠處轉移，其具體機制還待進一步研究。本研究后續(xù)擬通過熒光原位雜交技術、細胞質核分離實驗進行亞細胞定位，并通過RNA免疫共沉淀等實驗探討其可能的調控分子。

綜上所述，SPATA3-AS1在胃癌的EMT過程中發(fā)揮重要作用進而影響胃癌進展。其可能通過調控轉錄因子Twist1、Snail，進而調控間質標志物N-cad及上皮標志物E-cad表達，從而調控胃癌EMT。后續(xù)研究將進一步探討SPATA3-AS1、癌基因與 EMT之間的關系進而闡明SPATA3-AS1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制。