X 射線誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞凋亡的適應(yīng)性反應(yīng)及相關(guān)miRNA 篩選的研究

余小玲 榮利 方芳 丁曉文 王洪勝 謝婷婷 牛東升 王小春 李玨

北京市化工職業(yè)病防治院北京市職業(yè)病防治研究院科研部 100093

輻射適應(yīng)性反應(yīng)（adaptive response，AR）是靶物質(zhì)（如細(xì)胞）先暴露于一個(gè)較低的輻射劑量，間隔一段時(shí)間后，再接受較大劑量（效應(yīng)劑量）照射，靶細(xì)胞對(duì)大劑量照射引起的生物效應(yīng)產(chǎn)生抵抗[1]。低劑量輻射誘導(dǎo)的AR 為當(dāng)前放射生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。微RNA（microRNAs，miRNA）作為內(nèi)源性非編碼小RNA 分子，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡及細(xì)胞免疫應(yīng)答等重要生物過(guò)程[2]。有研究者發(fā)現(xiàn)，部分miRNA 通過(guò)調(diào)控DNA 雙鏈斷裂修復(fù)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性[3-4]；或通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路上下游分子影響電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮生物功能[5-6]。盡管已有研究結(jié)果表明，miRNA 可以調(diào)節(jié)電離輻射生物效應(yīng)，其在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平與電離輻射敏感性有關(guān)，但目前尚未見(jiàn)輻射誘導(dǎo)AR 相關(guān)的miRNA 研究報(bào)道。輻射誘導(dǎo)AR 相關(guān)miRNA 研究及其調(diào)控機(jī)制的闡明，對(duì)輻射防護(hù)有一定理論參考價(jià)值，而且篩選到的miRNA 還可能作為生物標(biāo)志物為臨床腫瘤放射治療方案的制定提供參考依據(jù)。本研究探索X 射線輻射誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）A549細(xì)胞凋亡的AR，并通過(guò)基因芯片篩選相關(guān)的miRNA，運(yùn)用生物信息學(xué)分析miRNA 調(diào)控的靶基因及信號(hào)通路，初步探索輻射AR 的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NSCLC A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，培養(yǎng)代次為16～27 代。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。5×106個(gè)/瓶A549 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10%青鏈霉素的（北京索萊寶科技有限公司）DMEM 完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行照射。

1.2 照射及實(shí)驗(yàn)分組

使用X 射線輻照儀[美國(guó)Precision X-ray（PXi）公司，型號(hào)X-RAY 225]進(jìn)行細(xì)胞照射，劑量率分別為0.38 Gy/min（低劑量50、200 mGy 照射時(shí)源距96 cm）和0.96 Gy/min（效應(yīng)劑量20 Gy 照射時(shí)源距60 cm）。將A549 細(xì)胞分為6 組，包括50 mGy+20 Gy、200 mGy+20 Gy、20 Gy、50 mGy、200 mGy照射組及對(duì)照組（0 Gy），前2 組細(xì)胞分別用50、200 mGy 初始劑量進(jìn)行照射，培養(yǎng)6 h 后用20 Gy的效應(yīng)劑量進(jìn)行照射，同時(shí)，20 Gy、50 mGy、200 mGy 照射組分別用20 Gy、50 mGy、200 mGy進(jìn)行照射，對(duì)照組不照射。

1.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用碘化丙啶（PI）/Annexin-V 雙染法（美國(guó)BD 公司）進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。不同劑量照射A549 細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，210×g離心5 min 后，用PBS 重懸細(xì)胞，洗2 次，用100 μL 1×Annexin V 緩沖液（美國(guó)BD 公司）重懸細(xì)胞。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入PI、Annexin-V 染料，4℃染色30 min。染色后加入PBS，4℃、210×g離心5 min，洗2 次，細(xì)胞用400 目尼龍膜過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司Accuri C6 Plus 型）進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

1.4 RNA 的提取及測(cè)序

用TRIzol 試劑（北京索萊寶科技有限公司）裂解照射后的A549 細(xì)胞，按照試劑盒的說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。每個(gè)樣本提取10 μg 總RNA，利用NanoDrop（美國(guó)LabTech 公司）進(jìn)行RNA 質(zhì)檢。質(zhì)檢合格的樣品用于后續(xù)miRNA 測(cè)序分析。使用Small RNA Sample Pre Kit（美國(guó)Illumina 公司）構(gòu)建文庫(kù)，利用miRNA 的3′及5′端特殊結(jié)構(gòu)，直接將RNA 兩端加上接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳分離目標(biāo)DNA 片段，切膠回收得到cDNA 文庫(kù)。質(zhì)檢合格后的文庫(kù)按照有效濃度進(jìn)行HiSeq/MiSeq 測(cè)序。本研究miRNA 測(cè)序及前期數(shù)據(jù)分析均由天津諾禾致源公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)各樣品中miRNA 進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并用TPM（transcript per million）進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理[7]。聚類(lèi)圖由cluster 3.0 軟件生成，由總信號(hào)密度大于1000 的miRNA 生成。用火山圖推斷差異miRNA 的整體分布情況，從差異倍數(shù)和校正后的顯著水平（q＜0.05）進(jìn)行評(píng)估，篩選差異miRNA[8-9]，篩選條件為q＜0.01、log2（差異倍數(shù)）＞1。采用miRanda、RNAhybrid 軟件對(duì)各比較組之間差異表達(dá)miRNA 靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)miRNA 靶基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋分析。GO 富集分析方法為GO seq，其能準(zhǔn)確地計(jì)算出GO 條目被候選靶基因富集的概率[10]。京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路顯著性富集分析是以KEGG通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，與整個(gè)基因組背景相比，找出在候選靶基因中顯著性富集的通路[11]。對(duì)候選靶基因中顯著性富集的信號(hào)通路采用Benjamini&Hochberg（BH）的方法對(duì)P值進(jìn)行校正（P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即顯著性富集）。

1.6 miRNA 表達(dá)水平驗(yàn)證

為了驗(yàn)證miRNA 測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)挑選10 個(gè)50 mGy+20 Gy 照射組和200 mGy+20 Gy 照射組差異表達(dá)趨勢(shì)相同的miRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證其表達(dá)水平。使用SuperTaq 聚合酶（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）和MicroRNAs qPCR SYBR Green 試劑盒（上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行檢測(cè)。使用miRNA 特異性引物從總RNA 中擴(kuò)增獲取cDNA，其引物見(jiàn)表1。使用qRT-PCR 儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 7500fast 型）進(jìn)行分析。Ct 值被定義為熒光通過(guò)固定閾值的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。U6 作為內(nèi)參基因，各組間的miRNA 相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct計(jì)算[12]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，采用Welcht檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間的比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X 射線誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的AR

50 mGy+20 Gy 照射組和200 mGy+20 Gy 照射組的A549 細(xì)胞早期凋亡率分別為（1.81±0.11）%和（2.17±0.19）%，低于20 Gy 照射組的（4.54±0.23）%，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；50 mGy 照射組、200 mGy 照射組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.165、0.078，均P＞0.05）（圖1）。以上結(jié)果表明，50 mGy和200 mGy 照射劑量的X 射線均能誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的AR。

圖1 X 射線照射后非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的凋亡率 a 表示與20 Gy 照射組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.680、8.006，均P＜0.01）Figure 1 Apoptosis rate of non-small-cell lung cancer A549 cells after irradiated by X-rays

2.2 miRNA 表達(dá)譜的變化

本研究中50 mGy+20 Gy、200 mGy+20 Gy、20 Gy 照射組鑒定到的成熟miRNA 的個(gè)數(shù)分別為649、681、905 個(gè)，差異表達(dá)miRNA聚類(lèi)分析熱圖見(jiàn)圖2。與20 Gy 照射組相比，50 mGy+20 Gy照射組上調(diào)miRNA 有7 個(gè)、下調(diào)miRNA 有36個(gè)；200 mGy+20 Gy 照射組上調(diào)miRNA 有23 個(gè)、下調(diào)miRNA 有40 個(gè)（圖3）。與20 Gy 照射組相比，50 mGy+20 Gy 照射組、200 mGy+20 Gy 照射組共同差異表達(dá)的miRNA 有1 個(gè)上調(diào)、15 個(gè)下調(diào)（表2）。

表2 X 射線照射后非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的16 個(gè)差異表達(dá)的miRNATable 2 Sixteen microRNAs differentially expressed in non-small cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation

圖2 X 射線照射后3 組非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 的聚類(lèi)分析熱圖 以log10（TPM+1）值進(jìn)行聚類(lèi)分析，紅色表示高表達(dá)miRNA，藍(lán)色表示低表達(dá)miRNA。miRNA 為微RNA；TPM 為transcript per millionFigure 2 The heatmap of unsupervised hierarchical clustering of microRNAs expression in three groups of non-small-cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation

圖3 X 射線照射后3 組非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的差異miRNA 火山圖 差異小分子RNA 篩選條件為q＜0.01、log2（差異倍數(shù)）＞1。miRNA 為微RNAFigure 3 The volcano plot of microRNAs expression in three groups of non-small-cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation

2.3 差異表達(dá)miRNA 調(diào)控靶基因的GO 富集分析

miRNA 靶基因進(jìn)行GO 功能注釋分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同差異表達(dá)miRNA 調(diào)控靶基因注釋功能最多的是生物過(guò)程，其次為細(xì)胞組分及分子功能（表3）。對(duì)miRNA 調(diào)控的靶基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同差異表達(dá)miRNA 調(diào)控的靶基因顯著富集于溶酶體、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路和Rap1 信號(hào)通路等（圖4）。

圖4 KEGG 分析X 射線照射后非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞差異表達(dá)微RNA 調(diào)控靶基因的功能信號(hào)通路 富集指數(shù)為差異表達(dá)的基因中位于該通路條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該通路條目的基因總數(shù)的比值，其值越大，表示富集程度越大；P 值越小，表示富集程度越大。KEGG 為京都基因與基因組百科全書(shū)；GABA 為γ-氨基丁酸；VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；MAPK 為絲裂原活化蛋白激酶Figure 4 Kyoto encyclopedia of genes and genomes analysis of functional signaling pathways of target genes regulated by differentially expressed microRNAs in non-small-cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation

表3 X 射線照射后非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞差異表達(dá)微RNA 調(diào)控靶基因的GO 富集分析（前15 位）Table 3 Gene ontology enrichment analysis of target genes regulated by differentially expressed microRNAs in non-small cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation (TOP 15)

2.4 qRT-PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA 的表達(dá)水平

miRNA 表達(dá)情況與基因芯片結(jié)果趨勢(shì)一致（圖5）。50 mGy+20 Gy 照射組和200 mGy+20 Gy照射組共同表達(dá)上調(diào)的miR-3662 與20 Gy 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.55、5.97，均P＜0.01）。芯片測(cè)序結(jié)果中下調(diào)的9 個(gè)miRNA，包括miR-185-3p、 miR-1908-5p、 miR-1307-5p、 miR-182-3p、 miR-92a-3p、 miR-582-5p、 miR-501-3p、miR-138-5P 及miR-1260b，在50 mGy+20 Gy 照射組均下調(diào)，且與20 Gy 照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.64～39.83，均P＜0.01）。200 mGy+20 Gy照射組miR-138-5P、miR-1260b 的表達(dá)水平與20 Gy照射組相當(dāng)，其他7 個(gè)miRNA 表達(dá)水平均下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.92～26.81，均P＜0.05）。

圖5 X 射線照射后3 組非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞不同微RNA 的表達(dá)水平 a 表示與20 Gy 照射組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.92～39.83，均P＜0.05）Figure 5 Expression levels of different microRNAs in three groups of non-small-cell lung cancer A549 cells after X-ray irradiation

3 討論

隨著放射生物學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，低劑量電離輻射誘導(dǎo)的AR 越來(lái)越受到重視，并成為研究熱點(diǎn)。目前，在動(dòng)物活體及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均觀察到低劑量輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的AR[13-14]。低劑量電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 涉及的分子生物機(jī)制十分復(fù)雜，因此，深入探討低劑量電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 的規(guī)律和機(jī)制很有必要。本研究基于小RNA 測(cè)序技術(shù)篩選與X 射線輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡AR 相關(guān)的miRNA，初步探索輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 的可能機(jī)制。

據(jù)報(bào)道，行75 mGy X 射線（12.5 mGy/min）照射后，間隔3～24 h，再進(jìn)行1.5 Gy（287 mGy/min）照射，可誘導(dǎo)體外EL-4 淋巴瘤細(xì)胞凋亡的AR[14]。Chen 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，50 mGy α 粒子照射后可誘導(dǎo)NSCLC A549 細(xì)胞對(duì)后續(xù)750 mGy α 粒子照射產(chǎn)生放射抗性，即輻射AR。以往的研究結(jié)果顯示，NSCLC A549 經(jīng)8 Gy X 射線照射后，細(xì)胞凋亡率為4%～5%，為輻射不敏感細(xì)胞[16]。在本研究中，20 Gy X 射線照射后A549 細(xì)胞凋亡率為5%左右。本研究中初始劑量照射劑量率為0.38 Gy/min，且200 mGy 照射劑量也處于目前低劑量輻射定義的臨界點(diǎn)[17]。這提示低劑量輻射誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡AR 與照射劑量及劑量率可能均有關(guān)。

miRNA 參與多種細(xì)胞分子功能的調(diào)節(jié)，細(xì)胞在接受電離輻射后，細(xì)胞內(nèi)及血液中miRNA 表達(dá)水平均發(fā)生變化，這提示miRNA 在輻射生物效應(yīng)的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，可能作為輻射生物效應(yīng)產(chǎn)生的生物標(biāo)志物[3-6]。本研究通過(guò)小RNA 測(cè)序在50 mGy+20 Gy 照射組和200 mGy+20 Gy 照射組篩選到16 個(gè)共同差異表達(dá)的miRNA，且qRT-PCR 對(duì)部分miRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。有研究結(jié)果表明，miR-3662 在肺腺癌中的表達(dá)水平升高，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[18]。另有研究結(jié)果顯示，miR-3662 靶向于在健康肺組織中高表達(dá)的基因PTAR1、NPR3 和SEPT10。miR-3662 下調(diào)則促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而發(fā)展為肺腺癌，因此在肺腺癌的診斷中有重要意義[19]。而本研究中miR-3662是在2 組產(chǎn)生凋亡AR 的細(xì)胞中唯一共同上調(diào)表達(dá)的miRNA，這提示miR-3662 可能在X 射線輻射誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的AR 中發(fā)揮了重要作用。

2 組產(chǎn)生AR 的細(xì)胞中共同下調(diào)的miRNA 也在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。例如，miR-182 在NSCLC 中與FBXW7、FBXW11 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成、細(xì)胞周期進(jìn)展，同時(shí)可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。另有研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-182 可通過(guò)調(diào)控RECK 基因的表達(dá)，增強(qiáng)NSCLC A549 和肺腺癌H1299 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，從而促進(jìn)NSCLC 的進(jìn)展[21]。本研究中miR-182 在輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡AR 的NSCLC A549細(xì)胞中下調(diào)，這提示其可能在輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 機(jī)制中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

為進(jìn)一步研究共同差異表達(dá)的miRNA 是否參與了輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 的發(fā)生，我們對(duì)這些miRNA 調(diào)控的靶基因進(jìn)行功能注釋及信號(hào)通路分析。結(jié)果顯示，靶基因主要富集在溶酶體、MAPK信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路及Rap1 信號(hào)通路等。MAPK 及其家族蛋白質(zhì)，包括胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、應(yīng)激活化蛋白激酶等，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞并參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過(guò)程[22-23]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，靶向Ras-MAPK 信號(hào)通路的miRNA 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。如miR-382、miR-34a 及miR-124 能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞黏附和細(xì)胞周期，并同時(shí)活化免疫系統(tǒng)相關(guān)通路[24-25]。Mutlu 等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-564 通過(guò)ERK1/2磷酸化調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路，使細(xì)胞阻滯在G1期。有研究者發(fā)現(xiàn)，突變Ras 等位基因的表達(dá)可以改變腫瘤細(xì)胞的敏感性，并在暴露于電離輻射后增加其存活率。在一些Ras 活性和野生型P53 細(xì)胞系中，抑制MEK 可能通過(guò)P53 誘導(dǎo)而致放射增敏[27]。而單次高劑量輻射，可通過(guò)調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡來(lái)介導(dǎo)其抗腫瘤作用[28]。本研究中miRNA調(diào)控的靶基因顯著富集的MAPK、Ras 信號(hào)通路等有可能在低劑量輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的AR 產(chǎn)生中有重要作用，有待在接下來(lái)的研究中進(jìn)一步闡明。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)低劑量X 射線能誘導(dǎo)NSCLC A549細(xì)胞凋亡的AR。并通過(guò)小RNA 測(cè)序篩選到一組差異表達(dá)的miRNA，其靶基因顯著富集至MAPK、RAS 等信號(hào)通路。這提示篩選出來(lái)的miRNA 可能在低劑量輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡AR 機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可能成為輻射效應(yīng)的重要生物靶標(biāo)，作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床腫瘤放射治療。本研究不僅對(duì)放射生物學(xué)的研究具有理論意義，而且對(duì)輻射防護(hù)和臨床醫(yī)學(xué)腫瘤放射治療具有一定實(shí)用價(jià)值。未來(lái)，我們將對(duì)篩選到的miRNA 在輻射誘導(dǎo)的AR中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，并在動(dòng)物活體水平上進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開(kāi)展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明 余小玲負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)方法的建立和實(shí)施、數(shù)據(jù)的分析、文章的撰寫(xiě)；榮利、方芳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施；丁曉文、王洪勝負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的分析；謝婷婷負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)樣本的準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)的整理；牛東升、王小春、李玨負(fù)責(zé)課題的設(shè)計(jì)和指導(dǎo)、論文的修訂。