基于SSR標(biāo)記的東北杏遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

董勝君，王新鑫，張皓凱，陳建華，劉權(quán)鋼，徐 豪

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽110161）

東北杏（Armeniacamandshurica）為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）杏屬（Armeniaca）喬木，原產(chǎn)于遼寧、吉林[1]，在東北三省、俄羅斯遠東地區(qū)及朝鮮半島北部均有分布。東北杏樹體高大，花果可賞，可做園林應(yīng)用；其根系發(fā)達，落葉豐富，抗逆性強，是東北地區(qū)營建水源涵養(yǎng)林的優(yōu)良樹種；東北杏種仁的苦杏仁甙含量豐富，外用抗炎殺菌[2]，內(nèi)服鎮(zhèn)咳平喘[3]，藥用價值高；種仁含油率高于47%，且油脂脂肪酸組成及生物柴油燃料性能表現(xiàn)良好[4]，是極具開發(fā)潛力的樹種，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟和社會價值。

目前，東北杏多數(shù)處于野生、半野生狀態(tài)[5]，分析其遺傳多樣性能為東北杏種質(zhì)資源的保護利用提供理論指導(dǎo)。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究植物遺傳多樣性，相比表型性狀[6]而言，能夠直接反映遺傳物質(zhì)差異，且不受到季節(jié)、環(huán)境等因素影響。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性、可重復(fù)性等優(yōu)點，因而廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[7-11]。在杏屬植物中，SSR引物開發(fā)成熟且通用性高，前人應(yīng)用SSR標(biāo)記對普通杏（PrunusarmeniacaL.）[12]、新疆野杏（ArmeniacavulgarisLam.）[13]、西伯利亞杏（Prunussibirica）[14]、梅（Prunusmume）[15]等進行了遺傳多樣性分析，而東北杏的相關(guān)研究鮮見報道。自然界中東北杏遺傳多樣性豐富，普遍存在種間雜交現(xiàn)象[16]，基于表型性狀鑒定東北杏種質(zhì)則存在一定的難度。應(yīng)用SSR標(biāo)記構(gòu)建的SSR指紋圖譜，具有高度個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，能從分子水平上更為精確地鑒定種質(zhì)，已廣泛應(yīng)用在蘋果屬（MalusMill.）[17]、甜櫻桃（PrunusavinumL.）[18]、榴蓮（Duriozibethinus）[19]、無花果（FicuscaricaLinn.）[20]、油茶（CamelliaoleiferaAbel.）[21]等樹種的種質(zhì)鑒定中。

本研究以來自10個種源的61份東北杏種質(zhì)為試驗材料，基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對東北杏的遺傳多樣性進行評價，探討東北杏遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，并構(gòu)建東北杏SSR指紋圖譜，旨在為東北杏種質(zhì)資源的有效保護利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取東北杏自然地理分布區(qū)10個種源的61份東北杏種質(zhì)作為供試材料，遼寧省包括32份種質(zhì)，其中，丹東市3份，本溪市6份，撫順市6份，沈陽市17份；吉林省包括17份種質(zhì)，其中，白山市3份，吉林市8份，延邊朝鮮族自治州6份；黑龍江省包括12份種質(zhì)，其中，牡丹江市4份，哈爾濱市5份，雞西市3份。具體地理位置信息見圖1。

圖1 61份東北杏種質(zhì)的地理分布Figure 1 Geographical distribution of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取、PCR擴增及檢測 選用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取東北杏樣木陽面1年生枝條上嫩葉的DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計對DNA的質(zhì)量和濃度檢測后，置于-20℃冰箱中保存。依據(jù)課題組前期測序結(jié)果，由北京賽百盛生物工程有限公司合成600對SSR引物，從中選擇101對擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物，并按照SSR-PCR反應(yīng)體系[22]進行擴增。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，經(jīng)過固定、染色、漂洗、顯影等步驟后，置于凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，USA）中拍照記錄。

1.2.2 數(shù)據(jù)讀取與分析 利用Image Lab 4.0軟件讀取凝膠影像條帶，獲得原始基因型結(jié)果，并運用DataTrans 2.0軟件轉(zhuǎn)換為基因型數(shù)據(jù)和“0”和“1”的矩陣。通過POPGENE 32軟件和CERVUS軟件計算遺傳參數(shù)。利用NTSYS2.10和MEGA 5.1軟件進行種質(zhì)間和種源間的UPGMA聚類分析,應(yīng)用NTSYS2.10軟件和GenAlEx 6.502軟件計算種質(zhì)間遺傳距離和地理距離，并進行Mantel檢驗。利用ClusterProject軟件構(gòu)建種質(zhì)的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點多態(tài)性分析

利用101對引物對61份東北杏種質(zhì)進行擴增，結(jié)果見表1。101個SSR位點的平均觀測等位基因為9.6436，有效等位基因比例在55.13%。等位基因數(shù)目存在差異，最多的有23個（位點Y109、P21），最少的有4個（位點X3H、X9H、X19H、X128、L62、Y44、Y48），且Na≥10有38對引物，Na≥15有16對引物，Na≥20有5對引物。不同位點的PIC變化范圍在0.5030～0.9250之間，平均值為0.7316，其中，PIC值最高的位點為P58H（0.9250），PIC值最低的位點為Y50（0.5030），各位點PIC值均高于0.5。61份東北杏種質(zhì)的平均Shannon信息指數(shù)高達1.7533，而平均觀測雜合度（0.2155）低于平均期望雜合度（0.7711）。

表1 東北杏101個位點遺傳多樣性參數(shù)Table 1 Genetic diversity parameters of 101 loci in Armeniaca mandshurica

續(xù)表

2.2 不同種源東北杏群體遺傳多樣性分析

供試東北杏種質(zhì)的10個種源遺傳多樣性參數(shù)見表2。平均Shannon信息指數(shù)為0.7431，平均觀測等位基因2.8307，有效等位基因占比為78.63%，平均觀測雜合度（0.2113）低于平均期望雜合度（0.4678）。遼寧省沈陽市的東北杏遺傳多樣性最為豐富，各項指標(biāo)均為10個種源中的最大值（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164），而遼寧省丹東市的遺傳多樣性水平最低。綜合各遺傳多樣性參數(shù)，10個種源的東北杏遺傳多樣性差異較大，其多樣性水平依次為：遼寧省沈陽市＞吉林省吉林市＞遼寧省撫順市＞黑龍江省哈爾濱市＞吉林省延邊州＞黑龍江省牡丹江市＞遼寧省本溪市＞黑龍江省雞西市＞吉林省白山市＞遼寧省丹東市。

表2 東北杏10個種源遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of 10 provenances of Armeniaca mandshurica

2.3 聚類分析

2.3.1 東北杏種質(zhì)聚類分析 利用101個SSR位點數(shù)據(jù)分析東北杏種質(zhì)的遺傳相似性，結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)平均值為0.8361，數(shù)值范圍在0.7482～0.9410。其中，704號和705號東北杏種質(zhì)遺傳相似度最高（94.10%），均來自于遼寧省本溪市，說明二者之間的親緣關(guān)系較近；而來自黑龍江省牡丹江市的774號和來自遼寧省沈陽市的725號東北杏種質(zhì)遺傳相似度最低（74.82%），說明二者之間的親緣關(guān)系較遠。

聚類分析結(jié)果見圖2，遺傳相似系數(shù)0.842處可將所有種質(zhì)分為A、B、C、D共4類。A類、B類的東北杏種質(zhì)來源均為遼寧省，其中，716號、717號、718號、719號、720號5個來自沈陽市的種質(zhì)與遼寧省其他市的種質(zhì)聚為A類，共20份種質(zhì)；沈陽市內(nèi)其他種質(zhì)單獨聚為B類，共12份種質(zhì)；C類的東北杏種質(zhì)來源均為吉林省，共17份種質(zhì)；D類的東北杏種質(zhì)來源均為黑龍江省，共12份種質(zhì)。

圖2 基于SSR標(biāo)記的東北杏UPGMA樹狀圖Figure 2 UPGMA dendritic map of Armeniaca mandshurica based on SSR markers

A類在遺傳相似系數(shù)0.860處分成3個亞類。A1亞類共12個種質(zhì)，包括丹東市種質(zhì)、本溪市種質(zhì)和撫順市種質(zhì)（710號、711號、712號）；A2亞類共4個種質(zhì)，包括撫順市種質(zhì)（713號、714號、715號）與沈陽市的716號種質(zhì)；A3亞類共4個種質(zhì)，均來自沈陽市。

B類在遺傳相似系數(shù)0.844處可進一步分為兩個亞類，721號、722號、723號、724號、725號5個種質(zhì)聚為B1亞類；726號、732號、727號、728號、729號、730號、731號7個種質(zhì)聚為B2亞類。

C類在遺傳相似系數(shù)0.864處分為3個亞類。C1亞類共10個種質(zhì)，上支白山市種質(zhì)與吉林市種質(zhì)（744號、745號、746號）聚到一處，下支來自延邊朝鮮族自治州的748號、749號、750號種質(zhì)與吉林市種質(zhì)（747號）聚到一處；C2亞類共5個種質(zhì)，延邊朝鮮族自治州的751號、752號、753號種質(zhì)與來自吉林市的755號、756號種質(zhì)聚到一處；C3亞類包括吉林市的757號和758號種質(zhì)。

D類在遺傳相似系數(shù)在0.862處劃分為3個亞類。D1亞類共4個種質(zhì)，均來自黑龍江省牡丹江市；D2亞類共4個種質(zhì)，包括雞西市種質(zhì)和哈爾濱市種質(zhì)（776號）；D3亞類共4個種質(zhì)，均為哈爾濱市種質(zhì)。

2.3.2 東北杏種源聚類分析 基于10個種源間的遺傳距離矩陣做聚類分析，結(jié)果如圖3。在遺傳距離0.25處，可將其分為3類（P1、P2、P3），體現(xiàn)了地理種源的分布特點。P1類包括遼寧省的4個種源，其中，丹東市和本溪市親緣關(guān)系最近，然后與沈陽市、撫順市聚為一類；P2類包括吉林省的3個種源，延邊朝鮮族自治州與吉林市親緣關(guān)系最近，后與白山市聚為一類；P3類包括黑龍江省的3個種源，牡丹江市、雞西市的親緣關(guān)系略近于哈爾濱市。

圖3 基于UPGMA法的東北杏種源聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram for provenances of Armeniaca mandshurica

2.4 地理距離與遺傳距離的相關(guān)性

聚類結(jié)果與東北杏種源高度吻合，經(jīng)計算東北杏種質(zhì)間的遺傳距離變化范圍為0.279～4.762，地理距離變化范圍為0.002～755.333km，Mantel檢驗二者的相關(guān)性，結(jié)果見圖4。線性回歸方程為y=0.0035x+0.7606（R=0.752，p=0.010），說明東北杏種質(zhì)的地理距離與遺傳距離之間存在顯著的相關(guān)性。

圖4 東北杏種質(zhì)間遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性Figure 4 Correlation between genetic distance and geographic distance in Armeniaca mandshurica germplasms

2.5 東北杏SSR指紋圖譜構(gòu)建

按照PIC＞0.9的原則，從101對引物中篩選出8對引物，結(jié)合基因型數(shù)據(jù)、經(jīng)NTSYS2.10軟件聚類分析驗證，挑選出P58H（0.925）、L46（0.916）、L28H（0.903）3對引物。每對引物的區(qū)分能力不同，其中多態(tài)性最高的P58H引物僅能區(qū)分22份種質(zhì)，P58H和L46兩對引物組合能夠區(qū)分57份種質(zhì)，P58H、L46、L28H能區(qū)分全部的61份種質(zhì)，具體引物信息見表3。利用3對引物對61份東北杏種質(zhì)構(gòu)建的SSR指紋圖譜見圖5。

表3 3對SSR引物信息Table 3 The information of 3 pairs of SSR primer

圖5 61份東北杏種質(zhì)的SSR指紋圖譜Figure 5 SSR fingerprint of 61 Armeniaca mandshurica germplasms

3 討論與結(jié)論

每個等位基因相當(dāng)于一個具有不同重復(fù)單位拷貝數(shù)的DNA分子，位點的等位基因個數(shù)越多，意味著群體內(nèi)的基因型的數(shù)目越多[23]。本研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)對61份東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性進行分析，觀測等位基因（Na）平均值為9.6436。有效等位基因（Ne）反映了群體的變異程度，等位基因在群體中分布越均勻，Ne越接近Na值[24]。東北杏群體中Ne占比為55.13%，說明等位基因分布不均勻且存在稀有等位基因。101個位點的平均觀測雜合度（Ho=0.2155）低于平均期望雜合度（He=0.7711），說明東北杏群體的雜合度不足，普遍存在近交衰退現(xiàn)象。Shannon信息指數(shù)（I）的平均值為1.7533，多態(tài)信息含量（PIC）的平均值為0.7316，變化范圍在0.5030～0.9250之間，說明101個位點均為高度多態(tài)位點[25]。結(jié)合薔薇科樹種相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，認為同屬內(nèi)東北杏的遺傳多樣性豐富度低于新疆野杏[13]、普通杏[12]，高于西伯利亞杏[14]、梅[15]；與同科樹種相比，東北杏的遺傳多樣性豐富度低于山荊子[Malusbaccata(L.)Borkh.][26]，高于長柄扁桃（AmygdaluspedunculataPall.）[27]、西藏光核桃（Amygdalusmira）[28]、山櫻花[Cerasusserrulata(Lindley)Loudon][29]。

供試東北杏種源之間遺傳多樣性差異顯著，說明東北杏的遺傳基礎(chǔ)豐富，但分布不均勻，以沈陽市東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性最為豐富（Na=5.0891，Ne=3.2249，I=1.2006，Ho=0.2353，He=0.6164）。此外，各種源雜合度普遍較低，且觀測雜合度（0.1832～0.2353）低于期望雜合度（0.2878～0.6164），說明東北杏的近交衰退現(xiàn)象存在于各種源內(nèi)部，該結(jié)果為制定中國東北杏野生資源合理的保育策略提供了重要參考。

本研究供試的61份種質(zhì)來自10個不同種源，基本覆蓋東北杏的自然地理分布區(qū)域，具有一定代表性。在遺傳相似系數(shù)為0.842處可將東北杏種質(zhì)分為4類，遼寧省內(nèi)種質(zhì)大多聚為A類，僅沈陽市部分種質(zhì)聚為B類；吉林省內(nèi)種質(zhì)聚為C類；黑龍江省內(nèi)種質(zhì)聚為D類。對于東北杏的不同種源而言，在遺傳距離0.25處，可分為P1遼寧省種源、P2吉林省種源、P3黑龍江省種源3類。聚類結(jié)果表明，同一種源內(nèi)的種質(zhì)或者來自不同種源但地理距離較近的種質(zhì)存在較近的親緣關(guān)系。

地理隔離(IBD，isolation by distance)是指配子（如花粉）的擴散因受到地理距離的限制而出現(xiàn)遺傳分化[30-31]。基于有限的基因交流而產(chǎn)生顯著的遺傳差異，表現(xiàn)為隨地理距離增加，遺傳相似度隨之下降的現(xiàn)象[32]。通過Mantel檢驗?zāi)軌蜻M一步確定遺傳距離與地理距離之間是否存在線性相關(guān)性[33]。本研究中，地理距離與遺傳距離存在顯著的線性相關(guān)性（y=0.0035x+0.7606，R=0.752，p=0.010），表明東北杏存在IBD現(xiàn)象。杏屬植物中，西伯利亞杏[34]（R=0.453，p＜0.010）存在IBD現(xiàn)象；而普通杏[32]（p＞0.050）、野杏[13]（R=0.332，p=0.160）則不存在明顯的IBD現(xiàn)象。野生種群的遺傳變異模式復(fù)雜，本研究聚類結(jié)果中存在與地理隔離不一致的個別現(xiàn)象，如來自哈爾濱市的776號與相距較遠的雞西市種質(zhì)聚為D2亞類，可見地理隔離不是影響東北杏種內(nèi)遺傳分化的唯一因素。以植物景觀遺傳學(xué)的角度，環(huán)境因子的空間分異、地形起伏、生境梯度都有可能影響植物內(nèi)部的遺傳分化[35]，可做進一步研究調(diào)查，為東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性保護提供依據(jù)。

SSR指紋圖譜在植物上最直接的應(yīng)用，就是品種鑒定以及對品種質(zhì)量和純度的檢測[36]。傳統(tǒng)林木鑒別以形態(tài)系統(tǒng)分類法為主，而種內(nèi)不同種源、家系、無性系、品種間以及近緣種則從形態(tài)上較難區(qū)別，利用SSR指紋圖譜檢測到的一些在分子水平上的微小變異，能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳鑒別[37]。本研究利用SSR位點的PIC值和基因型數(shù)據(jù)，篩選出3對引物（L46、P58H、L28H）構(gòu)建SSR指紋圖譜，將東北杏的部分遺傳信息圖像化，能夠完全區(qū)分61份東北杏種質(zhì)，還能對未知種源的東北杏種質(zhì)進行種源鑒定。目前，普通杏[38]、西伯利亞杏[39]、梅[15]等杏屬植物均已構(gòu)建了SSR指紋圖譜，東北杏SSR指紋圖譜的補充，為杏屬植物的分類鑒定和保護利用提供了有力支撐。

本研究開展了基于SSR標(biāo)記的東北杏種質(zhì)的遺傳多樣性及其指紋圖譜構(gòu)建的研究，結(jié)果表明，東北杏具有豐富的遺傳多樣性，遼寧省沈陽市的遺傳多樣性最高；地理種源對東北杏的分類結(jié)果占據(jù)主導(dǎo)地位，地理距離與遺傳距離呈顯著相關(guān)，東北杏存在地理隔離現(xiàn)象；利用3對引物構(gòu)建了61份東北杏的SSR指紋圖譜，為東北杏種質(zhì)資源的鑒定評價、保育研究及合理開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。