近紅外熒光探針和成像系統(tǒng)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的初步探索

譚 旭，王 鈺，陳澤林，隆 磊，劉運(yùn)勝，王 平，史春夢(mèng)

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué),重慶 400038；2.華中科技大學(xué)，武漢 430063)

0 引言

近紅外熒光成像作為一種新興的生物醫(yī)學(xué)成像模態(tài),被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究以及臨床實(shí)踐,其核心在于研究開(kāi)發(fā)具有疾病特異性靶向的近紅外熒光探針和對(duì)應(yīng)的成像檢測(cè)設(shè)備。利用生物組織對(duì)近紅外光(通常指近紅外1區(qū)：700～900nm)的散射、吸收以及自發(fā)熒光顯著較低的特點(diǎn)，能獲得清晰的疾病組織結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)而引導(dǎo)對(duì)疾病組織精確切除[1]。吲哚菁綠[ICG(Indocyanine Green)；發(fā)射波長(zhǎng)～800 nm]，作為目前美國(guó)食品和藥物管理局(FDA) 唯一批準(zhǔn)的近紅外熒光分子，已有50余年的臨床應(yīng)用歷史。作用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管造影[2]、肝清除能力評(píng)估、胃腸道造影[3]、膽管造影[4]、輸尿管造影[5]、冠狀動(dòng)脈造影[6]、甲狀旁腺造影[7]、腫瘤前哨淋巴結(jié)造影[8]以及成像引導(dǎo)下的腫瘤組織切除，如原發(fā)肝癌和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶切除[9-12]，但是對(duì)于ICG在復(fù)雜創(chuàng)面中的應(yīng)用尚缺乏研究。雖然ICG具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值，但由于其體內(nèi)半衰期短、難以被細(xì)胞特異性攝取以及缺乏疾病特異性靶向蓄積，將極大地限制其臨床應(yīng)用前景。因此，亟需研發(fā)疾病選擇性蓄積的新型近紅外熒光探針[13]。目前用于臨床術(shù)中近紅外熒光成像的設(shè)備以美國(guó)的(Mini-FLARE)、法國(guó)的(Fluobeam)、加拿大的(SPYTM)以及日本的(PDETM)為代表[10]。它們均配備一個(gè)可移動(dòng)的手持式探頭，其可以同時(shí)激發(fā)檢測(cè)區(qū)域并接收近紅外熒光信號(hào)。這些系統(tǒng)能夠通過(guò)實(shí)時(shí)術(shù)中顯影將腫瘤、血管和淋巴結(jié)等組織結(jié)構(gòu)清晰地展現(xiàn)在外科醫(yī)生的手術(shù)視野中進(jìn)而幫助它們準(zhǔn)確地確定切除范圍。上述臨床手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)雖然表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價(jià)值，但由于均為進(jìn)口設(shè)備，相關(guān)研制技術(shù)對(duì)我國(guó)嚴(yán)格保密并被限制出口。因此，獨(dú)立自主地研究開(kāi)發(fā)近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)具有重大的意義。本研究報(bào)道課題組圍繞近紅外熒光成像探針、成像系統(tǒng)和臨床轉(zhuǎn)化評(píng)價(jià)開(kāi)展的探索研究，為開(kāi)發(fā)近紅外熒光成像的臨床應(yīng)用價(jià)值提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

近紅外熒光成像系統(tǒng)Fluobeam及近紅外熒光成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ樣機(jī)(武漢華眸光電科技有限公司研制)，具備術(shù)中實(shí)時(shí)成像、精確定位疾病(如腫瘤)并清晰分辨疾病邊界以及同步采集可見(jiàn)光圖像與近紅外熒光圖像等功能。Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System，具有小動(dòng)物活體熒光成像效果，同時(shí)基于其采集X-ray影像圖像的能力，精確定位疾病的解剖部位。

1.2 一般資料

納入研究代表性復(fù)雜創(chuàng)面病例包括：糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠(yuǎn)節(jié)部分缺如患者和右手木炭火焰燒傷兒童患者；通過(guò)全身靜脈給予ICG后行損傷局部血管近紅外熒光成像；另納入結(jié)腸癌患者手術(shù)切除腫瘤組織離體標(biāo)本經(jīng)IR-780局部灌注后進(jìn)行近紅外熒光成像。

1.3 近紅外熒光成像

對(duì)于糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠(yuǎn)端部分缺如患者及手部燒傷患者進(jìn)行損傷局部血管成像，于術(shù)前靜脈注射0.5 mg/kg ICG，然后立即于術(shù)中采集近紅外熒光圖像。對(duì)于結(jié)腸癌患者手術(shù)切除離體標(biāo)本腫瘤及淋巴結(jié)顯影，獲取結(jié)腸癌患者手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本(0.5 h以內(nèi))后，將IR-780通過(guò)殘端動(dòng)脈直接灌注到標(biāo)本中，4 h后進(jìn)行腫瘤及淋巴結(jié)近紅外熒光成像檢測(cè)，并將對(duì)應(yīng)腫瘤組織及淋巴結(jié)進(jìn)行冰凍切片，DAPI染色后通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)IR-780的細(xì)胞攝取情況。

2 結(jié)果2.1 ICG對(duì)復(fù)雜創(chuàng)面的在體血管成像與評(píng)價(jià)

結(jié)果如圖1所示，由于損傷局部的血管及淋巴

圖1 ICG血管造影評(píng)估損傷局部血供情況A. 右足踇趾潰瘍兼遠(yuǎn)端部分缺如患者的損傷局部血管造影；B. 右手木炭火焰燒傷患者的損傷局部血管造影

壓力不同，ICG能夠被動(dòng)地?cái)U(kuò)散蓄積到損傷局部。基于近紅外熒光成像系統(tǒng)Fluobeam獲得的近紅外熒光造影結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷局部的近紅外熒光信號(hào)出現(xiàn)更早、更強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。如圖1 A顯示，右足踇趾潰瘍兼遠(yuǎn)端部分缺如患者的損傷局部在注射ICG后7 s即顯現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，在13 s左右達(dá)到最強(qiáng)后急劇降低并維持穩(wěn)定，而其左側(cè)正常踇趾在注射后30 s才出現(xiàn)較為明顯的熒光信號(hào)，在45 s左右達(dá)到最強(qiáng)并緩慢降低，在注射后120 s兩側(cè)踇趾熒光信號(hào)強(qiáng)度均顯著降低且兩者之間無(wú)明顯差別。如圖1B顯示，右手木炭火焰燒傷患者的損傷局部在注射ICG后23 s檢測(cè)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，在27 s左右達(dá)到最強(qiáng)，而其左側(cè)正常手部在注射后35 s才出現(xiàn)較為明顯的熒光信號(hào)，在50 s左右達(dá)到最強(qiáng)并緩慢降低，在注射后180 s后左側(cè)手部熒光信號(hào)消失而右側(cè)損傷手部仍殘留比較明顯的熒光信號(hào)。

2.2 IR-780對(duì)手術(shù)切除腫瘤組織的特異性識(shí)別及淋巴結(jié)成像

針對(duì)代表性病例，將IR-780通過(guò)殘端動(dòng)脈灌注的方式直接將其注入臨床結(jié)腸癌病人標(biāo)本中，37℃孵育4 h后通過(guò)Kodak In-Vivo FX Professional Imaging System進(jìn)行近紅外熒光成像檢測(cè)，結(jié)果如圖2A所示，IR-780能夠識(shí)別出局部的腫瘤病灶

圖2 IR-780的腫瘤特異性識(shí)別及淋巴結(jié)顯影A. 結(jié)腸癌標(biāo)本的X-ray成像及特異性IR-780近紅外熒光成像圖片；B. 從結(jié)腸癌標(biāo)本中分離的淋巴結(jié)近紅外熒光成像及激光共聚焦檢測(cè)圖片

(藍(lán)色箭頭所指部位)。進(jìn)一步通過(guò)觸摸的方法分離出 8個(gè)淋巴結(jié)，其中6個(gè)有較強(qiáng)的IR-780熒光信號(hào)。分別挑選780陽(yáng)性和陰性熒光信號(hào)淋巴結(jié)(②和①)制作冰凍切片并進(jìn)行DAPI染色，然后通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)IR-780的細(xì)胞攝入情況。結(jié)果如圖2B所示，在IR-780陽(yáng)性信號(hào)淋巴結(jié)中檢測(cè)到對(duì)IR-780特異性攝入的細(xì)胞，推測(cè)這些細(xì)胞可能為轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞。

2.3 近紅外成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ的功能評(píng)價(jià)

基于上述研究基礎(chǔ)，開(kāi)展對(duì)國(guó)產(chǎn)近紅外應(yīng)成像系統(tǒng)TPS-785-Ⅲ的評(píng)價(jià)研究，如圖3A和圖3B所示，該系統(tǒng)通過(guò)術(shù)前給受檢測(cè)對(duì)象注射近紅外熒光探針，利用探針在病變部位選擇性地蓄積特性，然后通過(guò)近紅外光源(700～900 nm)激發(fā)探針獲得比激發(fā)光源波長(zhǎng)更長(zhǎng)的近紅外熒光信號(hào)，同時(shí)通過(guò)近紅外相機(jī)和彩色相機(jī)的信號(hào)接收器(CCD)分別接收熒光信號(hào)和可見(jiàn)光信號(hào)，并通過(guò)信息處理后將成像圖片顯示在顯示屏幕上。本成像系統(tǒng)具有高度集成便捷、成像速度快(30 fps)、成像視場(chǎng)大(100 mm×100 mm)、空間分辨率高以及同步采集可見(jiàn)光彩色圖像與近紅外熒光圖像等主要優(yōu)勢(shì)。建立4T1乳腺癌荷瘤C57小鼠模型，尾靜脈注射IR-780,24 h后通過(guò)TPS-785-Ⅲ近紅外手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)采集近紅外熒光成像圖像。結(jié)果如圖3C和圖3D所示，IR-780具有良好的腫瘤靶向顯影能力，顯示出TPS-785-Ⅲ系統(tǒng)具有良好近紅外成像功能。

圖3 TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像系統(tǒng)的外觀、工作原理以及應(yīng)用實(shí)例A. TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像系統(tǒng)外觀圖片；B. TPS-785-Ⅲ近紅外熒光成像統(tǒng)工作原理；C. C57荷瘤小鼠活體近紅外熒光成像圖像；D. 4T1乳腺癌荷瘤小鼠離體組織器官近紅外熒光成像圖像

3 討論

用于生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像的理想激發(fā)和發(fā)射光譜應(yīng)該具有較低的光散射、最低限度的組織吸收、可以忽略的自發(fā)熒光，疾病部位和正常部位之間能夠獲得良好的信噪比。近紅外熒光包括傳統(tǒng)的近紅外1區(qū)(NIR-1：700～900 nm)及近紅外2區(qū)(NIR-2：1000～1700 nm)源，由于組織光散射、光吸收及自發(fā)熒光顯著低于其他波段光源，因此,具有更深的組織穿透能力以及更高的信噪比，能夠?qū)崿F(xiàn)更深層組織的光學(xué)成像，進(jìn)而靶向識(shí)別并實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)深部疾病部位并引導(dǎo)對(duì)疾病組織精確切除。

本課題組前期在國(guó)際上首次報(bào)道以IR-780為代表近紅外七甲川花菁類熒光小分子探針，它們依賴于結(jié)構(gòu)內(nèi)在特性可被腫瘤細(xì)胞選擇性攝取并蓄積于腫瘤細(xì)胞線粒體[14-15]。該類近紅外熒光小分子在多種荷瘤動(dòng)物模型中表現(xiàn)出良好腫瘤成像能力以及腫瘤光熱、光動(dòng)力和化學(xué)治療活性。本文首次在結(jié)腸癌病人標(biāo)本中探索了IR-780的腫瘤及淋巴結(jié)成像能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR-780能夠特異性識(shí)別區(qū)分癌變組織及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。研究表明腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是預(yù)測(cè)病理分期及病人預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，因此，我們認(rèn)為IR-780具有精確引導(dǎo)對(duì)惡性病變組織切除并最大限度保留正常組織以及腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)清掃的能力，表現(xiàn)了較好臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的前景。

本文一方面利用法國(guó)的Fluobeam手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)，評(píng)估了ICG對(duì)復(fù)雜創(chuàng)面的在體血管成像效果。通過(guò)糖尿病右足踇趾潰瘍兼遠(yuǎn)端部分缺如患者及手部燒傷患者的損傷局部血管造影結(jié)果證實(shí)，基于ICG的近紅外成像在復(fù)雜創(chuàng)面?zhèn)樵u(píng)估中有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。另一方面，基于上述研究基礎(chǔ)，我們協(xié)作開(kāi)展對(duì)武漢華眸光電科技有限公司研制的近紅外熒光成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究，通過(guò)腫瘤特異性靶向的IR-780熒光探針小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。我們證實(shí)TPS-785-Ⅲ近紅外成像系統(tǒng)具有穩(wěn)定的近紅外成像能力，且該成像系統(tǒng)高度集成便捷、成像速度快、成像視場(chǎng)大、空間分辨率高以及能同步采集可見(jiàn)光彩色圖像與近紅外熒光圖像，表現(xiàn)出進(jìn)一步開(kāi)發(fā)前景。