ZnT3經由ERK通路影響老年小鼠認知能力

于 洋，王小梅，田 鶴，梅晰凡，張振興

(1. 錦州醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院，遼寧 121001；2. 錦州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，遼寧 121001)

0 引言

隨著社會經濟和醫(yī)療衛(wèi)生的發(fā)展，人們的壽命顯著延長，老年人口高齡化趨勢日益明顯。伴隨年齡的增加，機體的細胞、組織和器官不可避免地會發(fā)生生理性或病理性的改變，身體機能逐漸減弱[1]。大腦是人體耗氧量最大的器官，對衰老非常敏感，在腦衰老過程中，大量神經細胞死亡，突觸數量減少，學習記憶能力顯著下降[2-3]。鋅離子作為人體內含量第二豐富的微量元素，與神經元的存活和功能關系密切。鋅離子不能自由通過生物膜，其運輸主要依靠鋅轉運體(Zinc transporters, ZnT)家族和鋅轉運蛋白(Zrt-Irt like proteins, Zip)家族[4]。ZnT3是維持中樞神經系統(tǒng)鋅穩(wěn)態(tài)的重要鋅轉運體之一，ZnT3基因敲除小鼠學習記憶能力顯著下降[5]。在阿爾茨海默(Alzheimer’s disease, AD)模型小鼠的腦海馬內ZnT3的表達量顯著下降，鋅離子穩(wěn)態(tài)失衡，神經元凋亡增加[6]。在自然衰老過程中出現(xiàn)的學習記憶能力下降是否也與ZnT3有關，目前尚未見報道。因此，本研究應用Morris水迷宮測試衰老對小鼠學習記憶能力的影響，應用免疫組織化學、體視學和Western Blot技術對ZnT3在老年和青年小鼠海馬內的定位分布和定量表達進行檢測分析，并探索ZnT3影響學習記憶的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

C57BL/6J小鼠，雄性，2月齡12只，20月齡12只，體重25～30 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF動物室，實驗過程符合動物倫理標準。納入實驗的老年組小鼠血液生化指標檢測正常。兔抗鼠ZnT3抗體(proteintech)、兔抗鼠P-ERK和ERK抗體(abcam)、兔抗鼠GAPDH抗體(abcam)，SP9000免疫組化染色試劑、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物公司)、BCA蛋白質定量試劑盒(碧云天生物公司)、羊抗兔二抗(abcam)、PVDF膜(millipore)、ECL發(fā)光液(諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 Morris水迷宮測試

青年組和老年組小鼠首先進行5 d定位航行實驗，實驗時間設為120 s，小鼠面向池壁放入水中，從入水到找到平臺所需的時間即為潛伏期，若120 s內沒有找到安全平臺，將小鼠人為放置在平臺上10 s，潛伏期記為120 s，每日訓練兩次。實驗第6天進行空間搜索，撤走安全平臺，記錄60 s內小鼠穿越平臺的次數。

1.3 小鼠腦組織取材及標本處理

隨機挑選青年組和老年組小鼠各5只，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，小鼠麻醉后應用4%多聚甲醛灌注固定，迅速剝離出大腦，冠狀面切開，放入4%多聚甲醛溶液中固定，流水沖洗組織標本，常規(guī)脫水，透明、浸蠟、包埋，切成5 μm薄片，用于免疫組織化學染色。另取青年組和老年組小鼠各7只，麻醉后快速取出全腦組織，分離出海馬，凍存于-80℃，用于Western Blot實驗。

1.4 免疫組織化學染色方法檢測小鼠腦海馬組織中ZnT3的表達

應用SP法檢測小鼠腦組織中ZnT3蛋白的表達：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，高壓修復抗原，PBS漂洗3次后加入山羊血清，封閉10 min后甩掉血清，滴加兔抗鼠ZnT3抗體(1∶200)，4℃孵育12～16 h。PBS漂洗后，依次滴加多聚物和HRP標記的羊抗兔IgG，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明后封片。

1.5 體視學方法檢測小鼠腦海馬組織中ZnT3的表達量

青年組和老年組各隨機選取5張ZnT3免疫組化染色陽性圖片，每張圖片按照“S”形選取5個高倍視野，應用目鏡方格測試系統(tǒng)、點記數法測算ZnT3的體密度值。公式如下：VV=ΣPX/ΣPC，PX為方格測試系統(tǒng)落在陽性表達部位的點數，PC為方格測試系統(tǒng)落在參照系的點數。

1.6 免疫印跡方法檢測小鼠腦海馬組織中ZnT3、P-ERK和ERK蛋白含量

取-80℃保存的小鼠海馬組織，裂解提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，加入SDS上樣緩沖液，加熱至100℃變性。12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒壓濕轉法轉印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗鼠ZNT3 (1∶500)、兔抗鼠P-ERK (1∶1000)、兔抗鼠ERK (1∶1000)、兔抗鼠GAPDH (1∶3000)，4℃孵育16 h。TBST洗膜3次后加入羊抗兔IgG (1∶5000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后應用ECL法顯色，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件統(tǒng)計分析數據，用均數±標準差表示數據，應用ANOVA檢驗，組間比較用t檢驗，P<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 青年小鼠和老年小鼠學習記憶能力比較

Morris水迷宮實驗結果見圖1、圖2。隨著訓練時間的延長，老年小鼠和青年小鼠尋找安全平臺的潛伏期均減少，但是同一訓練時間，老年小鼠的逃避潛伏期明顯長于青年小鼠。空間探索實驗顯示老年小鼠穿越平臺次數明顯少于青年小鼠。這些結果表明，老年小鼠學習記憶能力明顯減退，衰老影響了認知能力。

圖1 青年和老年小鼠逃避潛伏期比較注：組間比較，*P<0.05,** P<0.01

圖2 青年和老年小鼠穿越平臺次數比較注：組間比較，*P<0.05,** P<0.01

2.2 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內ZnT3表達情況比較

免疫組織化學染色結果顯示ZnT3表達于小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及齒狀回(DG)內錐體神經元和顆粒細胞的胞質，陽性反應產物呈棕褐色。與青年小鼠比較，ZnT3在老年小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的陽性表達均顯著減少，齒狀回內ZnT3的陽性表達也弱于青年組(圖3)。體視學測量結果顯示，老年小鼠海馬組織CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回內ZnT3陽性表達的體密度值低于青年小鼠(表1)。免疫印跡結果與體視學結果一致，老年小鼠海馬組織中ZnT3蛋白含量下降明顯(圖4A, B)。

圖3 青年小鼠和老年小鼠腦海馬內ZnT3表達(SP，scale bar =100 μm)

表1 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內ZnT3體密度值

續(xù)表

2.3 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內P-ERK和ERK蛋白含量比較

細胞外調節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)屬于MAPK家族，磷酸化的ERK從胞質進入胞核，介導多種因子的轉錄分化。本實驗的免疫印跡結果顯示，老年小鼠海馬組織中ERK蛋白激酶的活性下降，P-ERK/ERK比值明顯小于青年組(圖4A, C)。

圖4 青年小鼠和老年小鼠腦海馬組織內ZnT3、P-ERK、ERK蛋白含量比較A：免疫印跡條帶；B：ZnT3含量分析；C：P-ERK/ERK，** P<0.01

3 討論

隨著科技的發(fā)展，人們的平均壽命大幅度延長，我國的人口老齡化問題日益嚴重。衰老不僅導致身體機能下降，也是造成AD和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等神經退行性疾病的主要風險因素[7]。神經系統(tǒng)作為人體重要的調節(jié)中樞最易受衰老影響，在衰老逐漸進行的過程中腦組織萎縮、神經細胞壞死凋亡、認知能力退化、學習記憶能力下降[8]。腦衰老的機制極為復雜，建立衰老模型是探索衰老機制的前提，本研究應用飼養(yǎng)20個月的小鼠進行研究，其病理變化最接近于自然衰老。通過Morris水迷宮檢測證實20月齡的小鼠學習記憶能力明顯減退，逃避潛伏期的時間明顯長于青年小鼠，穿越平臺次數明顯少于青年小鼠。

鋅是人體內第二豐富的微量元素，是多種酶和轉錄因子的組成成分，缺鋅可導致學習記憶障礙[9]。神經元內的鋅離子游離存在，依靠特定的轉運體跨膜轉運。ZnT3分布于突觸小泡膜上，可向突觸小泡內轉運鋅離子，在突觸活動時，鋅離子釋放，發(fā)揮其神經調質功能，影響突觸后神經元的功能活動[10]。文獻報道，AD小鼠海馬內ZnT3表達下降，其突觸小泡內鋅離子含量下降明顯；ZnT3基因敲除小鼠學習及記憶能力明顯減弱[11-12]。本研究通過免疫組織化學染色、體視學測量和免疫印跡技術檢測了青年小鼠和老年小鼠海馬組織內ZnT3的表達情況，結果顯示，老年小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及齒狀回內ZnT3的陽性表達均弱于青年小鼠。這一結果表明，衰老個體由于飲食等因素的影響，機體內鋅離子含量減少，從而影響生理活動。同時，由于ZnT3表達的下降，會導致鋅離子異常聚集于胞質，突觸的功能受到抑制，加重學習記憶能力的損傷。

在中樞神經系統(tǒng)，ERK激酶是記憶形成的相關分子，海馬神經元內ERK通路蛋白含量豐富，調控認知或發(fā)育[13]。文獻報道，鋅離子和鋅轉運體參與ERK信號通路的調控。ZnT3通過ERK通路影響神經元內質網的應激[14]。ZnT3基因敲除小鼠，其海馬神經元再生能力下降，ERK信號通路被抑制[15]。本實驗也檢測到衰老小鼠海馬組織內P-ERK/ERK比值下降，ERK通路磷酸化水平降低。這也證實，自然衰老的腦組織中ZnT3表達下降，突觸小泡內鋅離子含量減少，ERK通路被抑制，突觸后神經元的功能受到影響，學習記憶能力下降。