Ndfip1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)表達變化及其對老年斑沉積的影響

張程錦，田 娟

(錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

0 引言

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)屬于神經(jīng)退行性疾病，好發(fā)于老年人，主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙等癥狀。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該病患者腦內(nèi)可出現(xiàn)淀粉樣前體蛋白 (amyloid precursor protein, APP)的異常代謝以及Aβ (β-amyloid peptide)的沉積，最終形成老年斑 (senil plaque, SP)[1-2]。腦內(nèi)Aβ異常增生、聚集和沉積對神經(jīng)細胞具有損傷作用，可導(dǎo)致其壞死、功能喪失，這是誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一[3-4]。有報道稱，Ndfip1(Nedd4 family interacting protein 1)可通過泛素化降解途徑，清除神經(jīng)細胞中具有損傷作用的錯誤折疊的有害蛋白，減少神經(jīng)細胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護作用[5]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Ndfip1在大腦內(nèi)廣泛分布表達[6]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，Ndfip1在大腦皮質(zhì)、海馬表達，且在老年斑內(nèi)也有分布，提示Ndfip1可能參與Aβ的形成以及沉積過程。但兩者的關(guān)系目前尚未見報道。本研究首先觀察了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Ndfip1分布和表達情況，以及Ndfip1與Aβ老年斑的共定位，由此推測Ndfip1參與阿爾茨海默癥腦內(nèi)老年斑的形成過程。其次，通過體外實驗進一步檢測Ndfip1過表達對APPsw細胞APP代謝及Aβ分泌量的影響，以明確Ndfip1對APP代謝及Aβ分泌的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物培育、取材

48周齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson 實驗室。動物麻醉后處死，迅速取出腦組織，浸入4%多聚甲醛固定過夜；次日，將腦組織依次放入70%、80%、90%、95%、100%酒精逐級脫水后，再放入二甲苯直至組織變得半透明，隨后將腦組織取出，放入液態(tài)石蠟中浸蠟處理，包埋成石蠟塊后，切成厚度為7 μm的石蠟切片，撈片烘干后備用。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞系采用APPsw細胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人APP的SH-SY5Y細胞)。取凍存細胞置于38℃水中浴解凍，輕柔吸至含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)條件為 37℃，5% CO2和100%濕度。細胞接種于12孔板，接種密度為 2×105/mL。細胞貼壁生長后換雙無培養(yǎng)液(無血清無抗生素)繼續(xù)培養(yǎng)至80%融合。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

分別取1.5 μL LipofectamineTM2000和0.6 μg Ndfip1質(zhì)粒，均用雙無培養(yǎng)液稀釋至75 μL，混勻后靜置。取細胞清洗后加入300 μL雙無培養(yǎng)液，逐滴加入轉(zhuǎn)染混合液，放入培養(yǎng)箱6 h后，換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實驗組為Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞；對照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞。

1.4 主要試劑

Ndfip1質(zhì)粒(上海吉凱基因科技有限公司)，兔抗Ndfip1抗體、兔抗APP抗體(英國Abcam公司)，小鼠抗β-Amyloid抗體、DAPI、Texas Red(美國Santa Cruz公司)，F(xiàn)ITC(美國Jackson實驗室)，GAPDH單克隆抗體、辣根酶標記的羊抗兔IgG和辣根酶標記的羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Aβ1-42 ELISA試劑盒(上海晶抗)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)。

1.5 免疫熒光技術(shù)

石蠟切片常規(guī)進行脫蠟處理、水化。高壓修復(fù)后，PBS緩沖液洗3次，每次5 min。5%驢血清封閉1 h；加入兔抗Ndfip1抗體(稀釋比例1∶100)和小鼠抗β-Amyloid抗體(稀釋比例1∶400)，在濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。加入熒光二抗-Texas Red(紅)和FITC(綠)，在避光濕盒內(nèi)室溫孵育1 h。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。加入DAPI (藍)復(fù)染核，PBS緩沖液洗3次，每次5 min。封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察，照相保存。

1.6 蛋白印跡技術(shù)

收集動物腦組織和細胞，加裂解液裂解后離心，取上清液進行蛋白定量，分裝待用。配制分離膠和濃縮膠。將待檢測蛋白與上樣緩沖液混勻，沸水浴中加熱5 min使蛋白變性，上樣到加樣孔內(nèi)開始電泳，電壓100 V，設(shè)定120 min，至溴酚藍達膠底端停止電泳，轉(zhuǎn)膜1 h，將膜放入脫脂奶粉溶液封閉1 h，加兔抗Ndfip1(稀釋比例1∶200)抗體或兔抗APP(稀釋比例1∶200)抗體4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋比例1∶2000)孵育2 h，檢測蛋白條帶，掃描后應(yīng)用Photoshop 7.0軟件處理，內(nèi)參為GAPDH。

1.7 ELISA法

取細胞培養(yǎng)基，放入離心管內(nèi)低溫離心取上清液，-20℃保存待用。按說明書進行標準品的稀釋與加樣，稀釋后各孔加樣量為50 μL，濃度分別為1800 ng/L、1200 ng/L、600 ng/L、300 ng/L和150 ng/L。設(shè)空白孔(不加樣品及酶標試劑)和待測樣品孔(加樣品稀釋液40 μL和待測樣品10 μL)。37℃溫育30 min，棄去液體，甩干，加洗滌液洗30 s，重復(fù)5次，拍干。每孔加酶標試劑50 μL,37℃溫育30 min，棄去液體，甩干，加洗滌液洗30 s，重復(fù)5次，拍干。加顯色劑A 50 μL，顯色劑B 50 μL，混勻，37℃避光顯色15 min，加終止液50 μL，450 nm波長測量各孔吸光度。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 Ndfip1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬的分布與表達

免疫熒光三標共聚焦激光掃描結(jié)果顯示，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)可見Ndfip1陽性表達；海馬內(nèi)也可見Ndfip1陽性表達。Ndfip1分布于錐體神經(jīng)細胞的核周質(zhì)和突起內(nèi)。在Aβ陽性老年斑中可見Ndfip與Aβ共定位表達(圖1)。

圖1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Ndfip1定位分布(免疫熒光染色，Scale bar = 100 μm)紅色熒光：標記Ndfip1；綠色熒光：標記Aβ老年斑；藍色熒光：DAPI標記細胞核，白色箭頭和插入框顯示神經(jīng)元；黑色箭頭指示老年斑

蛋白印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，Ndfip1蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)的表達水平明顯下調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)，見圖2。同樣，Ndfip1蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬的表達水平也明顯下調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(**P<0.01)，見圖3。

圖2 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)Ndfip1蛋白表達變化(*P<0.05)A：電泳條帶；B：柱狀圖；Con：對照組；APP/PS1：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠組

圖3 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬Ndfip1蛋白表達變化(** P<0.01)A：電泳條帶；B：柱狀圖；Con：對照組；APP/PS1：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠組

2.2 Ndfip1過表達對APPsw細胞APP代謝及Aβ分泌量的影響

蛋白印跡技術(shù)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，與對照組相比，實驗組細胞內(nèi)APP695表達量明顯下調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)，見圖4。ELISA法檢測2組細胞條件培養(yǎng)基中Aβ1-42的水平，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞分泌的Aβ1-42明顯低于對照組，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)，見圖5。

圖4 Ndfip1過表達對APPsw細胞內(nèi)APP695表達的影響 (*P<0.05)A：電泳條帶；B：柱狀圖；pCMV-MCS：對照組即空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞；pCMV-MCS-Ndfip1：實驗組即Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞

圖5 Ndfip1過表達對APPsw細胞分泌Aβ1-42水平的影響(* P<0.05)pCMV-MCS：對照組即空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞；pCMV-MCS-Ndfip1：實驗組即Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的APPsw細胞

3 討論

AD主要病理學(xué)標志是腦部出現(xiàn)老年斑，其核心成分是Aβ。正常情況下APP通過α-分泌酶途徑降解形成可溶性的短鏈Aβ，但在AD早期APP的氨基端經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶異常水解產(chǎn)生不溶性的長鏈Aβ (主要是Aβ1-42) ，并在細胞外形成纖維狀聚合體，其神經(jīng)毒性可使周圍的神經(jīng)元變性死亡，最終形成以Aβ為核心，周圍為變性神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的老年斑。

Ndfip1屬于跨膜蛋白，它通過與Nedd4分子結(jié)構(gòu)的WW部位特異性結(jié)合，協(xié)助Nedd4蛋白催化泛素分子，使泛素易于與靶蛋白結(jié)合，即靶蛋白發(fā)生泛素化。蛋白酶體能夠識別并且降解泛素化的靶蛋白。這就是蛋白質(zhì)的泛素化降解過程[7-9]。蛋白質(zhì)泛素化降解過程在體內(nèi)普遍存在，特別是蛋白在某些誘導(dǎo)因素作用下發(fā)生錯誤折疊的時候。

Ndfip1在大腦內(nèi)廣泛表達。國外有研究者發(fā)現(xiàn)，Ndfip1在成人大腦左右半球、丘腦、腦垂體中均有較高表達[6]。本研究前期通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到，Ndfip1在小鼠大腦皮質(zhì)和海馬均有表達。在皮質(zhì)，Ndfip1廣泛分布；在海馬，局限表達于CA3區(qū)。本研究通過免疫熒光共聚焦技術(shù)同樣發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)均可見Ndfip1表達。大部分Ndfip1陽性表達位于錐體神經(jīng)元的核周質(zhì)和突起中。蛋白印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，Ndfip1蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)的表達水平明顯下調(diào)。提示Ndfip1可能參與阿爾茨海默癥的病理過程。近年來，研究者對Ndfip1在細胞內(nèi)定位也進行了深入的觀察，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、亞細胞分離法和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)檢測了內(nèi)源性Ndfip1 蛋白的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)Ndfip1蛋白定位表達于高爾基復(fù)合體；且Ndfip1異位表達可導(dǎo)致高爾基復(fù)合體結(jié)構(gòu)異常[10]。另有研究者通過細胞分級分離方法獲得細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)檢測到Ndfip1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有表達[11]。通過確定Ndfip1的亞細胞定位，學(xué)者們推測Ndfip1在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、加工和修飾過程中發(fā)揮重要的作用。

Ndfip1對大腦神經(jīng)細胞具有保護作用。Howitt等構(gòu)建了Ndfip1慢病毒表達載體和Ndfip1 shRNA慢病毒表達載體，分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞和人原代培養(yǎng)皮質(zhì)細胞并檢測神經(jīng)細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)Ndfip1過表達降低了神經(jīng)細胞的凋亡率[12]。本研究前期實驗也證實這一觀點[13-14]。在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生立早期(2 h內(nèi))大腦皮層基因轉(zhuǎn)錄水平變化研究中，Sang等通過SAGE和實時定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Ndfip1蛋白在外傷區(qū)域周圍的殘存神經(jīng)細胞上有明顯高表達，同時伴隨其結(jié)合蛋白Nedd4 表達水平增加，推測兩者的高表達及相互作用，可能有利于去除受損傷神經(jīng)細胞中有害的錯誤折疊蛋白，促進神經(jīng)細胞的存活[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)和海馬老年斑可見Ndfip1陽性表達，在其中心位置表達最為強烈，且與Aβ呈現(xiàn)部分共定位表達。提示Ndfip1可能參與Aβ沉積和老年斑形成過程。為了進一步明確Ndfip1對Aβ的調(diào)控作用，我們用Ndfip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染APPsw細胞使其過表達Ndfip1，隨后檢測細胞內(nèi)APP695蛋白含量，以明確Ndfip1對APP代謝的影響；應(yīng)用ELISA法檢測細胞條件培養(yǎng)基中Aβ1-42的水平以明確Ndfip1對Aβ分泌的影響。結(jié)果顯示，Ndfip1過表達可使APPsw細胞內(nèi)APP695表達下調(diào)，分泌的Aβ1-42減少。表明Ndfip1過表達能夠負性調(diào)控APP代謝過程，減少Aβ的分泌，減輕Aβ的沉積以及老年斑形成，減弱對神經(jīng)細胞的損傷作用，緩解疾病的病理過程。Ndfip1對Aβ產(chǎn)生和沉積的具體調(diào)控機制還有待于進一步深入研究。隨著Ndfip1參與阿爾茨海默癥病理過程的調(diào)控機制不斷揭示，將為該疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。