小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆與蛋白表達(dá)

周爽爽 劉榮

摘 ? ?要：本試驗(yàn)克隆了小貫小綠葉蟬（Empoasca onukii Matsuda）（原常稱為假眼小綠葉蟬）的化學(xué)感受蛋白基因14（EonuCSP14）（GenBank后登錄號(hào)為4YZPC5X701R），通過原核表達(dá)體系獲得其重組蛋白，并通過蛋白純化體系獲得了純蛋白，為小貫小綠葉蟬化學(xué)感受蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小貫小綠葉蟬;化學(xué)感受蛋白;基因克隆;蛋白表達(dá)

文章編號(hào)：1005-2690（2021）24-0016-02 ? ? ? 中國(guó)圖書分類號(hào)：Q966;S435.711 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

小貫小綠葉蟬是茶樹上為害較廣的害蟲，其為害嚴(yán)重威脅著我國(guó)的茶葉產(chǎn)量[1-2]。在關(guān)于害蟲的綠色生態(tài)防控技術(shù)研究中，昆蟲嗅覺識(shí)別機(jī)制是研究熱點(diǎn)之一[3]。化學(xué)感受蛋白CSPs是存在于昆蟲感器淋巴液中一類水溶性蛋白，分子量較小，其氨基酸序列具有Cys位點(diǎn)數(shù)量及位置保守的特征，是昆蟲識(shí)別、運(yùn)輸外界化學(xué)信息物質(zhì)的重要蛋白之一[4]，對(duì)CSPs功能的研究有助于完善昆蟲嗅覺識(shí)別機(jī)制[5]。

1 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆及分析

供試蟲源采集于貴州省都勻市（26°13′E，107°30′N）茶園中，于冰上切下其觸角并立即投入液氮保存?zhèn)溆?。用Invitrogen公司的Trizol試劑提取葉蟬觸角總RNA。用試劑盒合成cDNA第一條鏈。通過NCBI獲得EonuCSP14基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物后，由生物公司合成。經(jīng)PCR擴(kuò)增體系得到目的基因產(chǎn)物，電泳后利用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit回收PCR產(chǎn)物，與pMD-18T Vector一起水?。?2 ℃，4 h），獲取重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆測(cè)序，比對(duì)獲得目的基因克隆體。利用“http：//web.expasy.org/compute_pi/”預(yù)測(cè)等電點(diǎn)、分子量，利用“http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/”預(yù)測(cè)N-末端信號(hào)肽序列。

2 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14的原核表達(dá)及純化

試驗(yàn)菌株：克隆菌株pMD-18T-EonuCSP14-DH5，pET-32b空載體表達(dá)菌株。

主要儀器：SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)，蛋白純化儀，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，酶標(biāo)儀。

2.1 ? 提取質(zhì)粒

將克隆菌株、pET-32b空載體表達(dá)菌株，分別接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過大腸桿菌菌液提取質(zhì)粒的方法，分別提取含有目的基因的克隆菌株質(zhì)粒和pET-32b空表達(dá)載體質(zhì)粒。

2.2 ? 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

在37 ℃水浴條件下，將EcoRI（1 μL）、XhoI（1 μL）、質(zhì)粒（30 μL）、10×H Buffer（5 μL）、ddH2O（13 μL）混合反應(yīng)3 h，分別將克隆菌株質(zhì)粒和空表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切。電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，回收目的基因。在16 ℃水浴條件下，將目的基因回收產(chǎn)物（6.5 μL）、表達(dá)載體回收產(chǎn)物（2 μL）、10×T4 ligase Buffer（1 μL）、T4 DNA ligase（0.5 μL）混合反應(yīng)4 h，將目的基因連接到表達(dá)載體pET-32b上，轉(zhuǎn)化到克隆菌株后提取單克隆測(cè)序。用正確的菌株提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3）。測(cè)序確定正確的單克隆后，保存菌液，用于目的蛋白表達(dá)。

2.3 ? 目的蛋白的試表達(dá)及檢測(cè)

將上報(bào)保存的菌液搖菌活化（37 ℃，220 r/min），培養(yǎng)過夜。次日，用含有對(duì)應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液，按1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)（37 ℃，220 r/min），直至菌液OD600在0.6～0.8之間，加入誘導(dǎo)劑（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h（取未誘導(dǎo)菌液作為CK）。

誘導(dǎo)后，取菌液離心（100 μL），保留上清13 μL重懸，沸水浴10 min（加入8 μL4×蛋白樣品緩沖液，保護(hù)目的蛋白），室溫短暫離心1 min。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。確定表達(dá)后，收集菌液進(jìn)行細(xì)胞破碎，檢測(cè)蛋白可溶性。

2.4 ? 靶蛋白的大量表達(dá)

試表達(dá)成功后，進(jìn)行大量表達(dá)。擴(kuò)大培養(yǎng)后4 ℃離心收集菌體，按50∶1加入Tris-HCl（30 mmol/L，pH值7.4）洗滌溶解。菌體溶解液，反復(fù)凍融2～3次后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5 ? 靶蛋白的純化及酶切

將上述菌體加入蛋白酶抑制劑后超聲破碎，收集上清利用鎳柱親和層析法進(jìn)行純化酶切標(biāo)簽獲得純蛋白，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)[6]。

2.6 ? 蛋白濃度的測(cè)定及結(jié)合物質(zhì)配制

根據(jù)Bradford蛋白定量檢測(cè)試劑盒說明書，測(cè)定蛋白濃度。熒光探針配制：先用色譜級(jí)甲醇將熒光探針（1-NPN）配制母液（100 mmol/L），再稀釋成工作液（1 mmol/L），保存于-20 ℃。

2.7 ? 熒光探針適合性測(cè)定

將1-NPN工作液逐一加入上述試驗(yàn)保存的EonuCSP14蛋白溶液中（2 μmol/L），終濃度梯度范圍為0～50 μmol/L。在熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)熒光值，計(jì)算解離常數(shù)K1-NPN，分析EonuCSP14蛋白與該探針的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合適應(yīng)性。如果1-NPN和EonuCSP14蛋白的結(jié)合具有飽和效應(yīng)，Scatchard分析呈線性化關(guān)系，說明1-NPN可用于該蛋白的后續(xù)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。

3 ? 結(jié)果與分析

3.1 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因克隆結(jié)果

通過PCR獲得了目的基因擴(kuò)增片段，通過轉(zhuǎn)化，挑取單克隆測(cè)序，確定獲得EonuCSP14基因的克隆菌株。本次試驗(yàn)克隆的EonuCSP14基因大小為402 bp，以DL2000Marker作對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)測(cè)大小相符合（圖1）。

3.2 ? 小貫小綠葉蟬EonuCSP14基因序列分析

本次試驗(yàn)中克隆的EonuCSP14基因，具有完整的開放閱讀框，大小為402 bp，編碼133個(gè)氨基酸;經(jīng)預(yù)測(cè)網(wǎng)址預(yù)測(cè)顯示，EonuCSP14分子量為14.99，等電點(diǎn)為8.99，包含21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。

3.3 ? 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)

成功構(gòu)建了以pET-32b為表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化得到的表達(dá)菌株，在常規(guī)條件下誘導(dǎo)3 h（37 ℃，220 r/min，IPTG終濃度0.1 mmol/L），成功表達(dá)了目的蛋白。細(xì)胞破碎后檢測(cè)表明目的蛋白可溶，即上清中存在融合蛋白。細(xì)菌裂解液經(jīng)洗脫、酶切去除標(biāo)簽、純化得到了目的蛋白（圖2）。因目的蛋白含有信號(hào)肽，在表達(dá)純化過程中去除了信號(hào)肽，因此純化后的目的蛋白分子量小于14.99。

3.4 ? 蛋白濃度的測(cè)定

按照Bradford蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r2=0.99，說明測(cè)得的蛋白濃度可信。

3.5 ? 熒光探針適合性檢驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，隨著1-NPN濃度的增加，蛋白與探針結(jié)合的熒光值相應(yīng)升高，最后趨于飽和（圖3）;檢測(cè)結(jié)果通過Scatchard分析后呈線性化關(guān)系（圖4），說明1-NPN與EonuCSP14蛋白的結(jié)合是一對(duì)一的結(jié)合，可作為競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)探針。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖強(qiáng).“張冠李戴”話茶小綠葉蟬[J].中國(guó)茶葉，2019（5）：14-16.

[2]曹馨月，王迎春，龔雪蛟，等.小貫小綠葉蟬區(qū)域性發(fā)生規(guī)律和綜合防治[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2018，38（12）：25-32.

[3]袁爭(zhēng)，張亮，孫欽玉，等.茶小綠葉蟬綜合治理技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)茶葉加工，2010（4）：13-18.

[4]劉孝賀，孫麗娜，張懷江，等.昆蟲化學(xué)感受蛋白研究進(jìn)展[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2020，10（6）：22-26.

[5]王曉雙，唐良德，吳建輝.昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2017，38（6）：1171-1179.

[6]許沖.班氏跳小蜂氣味結(jié)合蛋白嗅覺功能分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.