不同處理方式艾燃燒生成物對動脈粥樣硬化小鼠炎癥及斑塊穩(wěn)定性的影響*

黃躍平 姚 琴 歐陽夏荔 劉津藝 惠 鑫 王 昊 和 蕊 張 瑞 趙百孝

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

動脈粥樣硬化（AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)［1］。中醫(yī)認(rèn)為AS是因臟腑功能失調(diào)，釀生痰濁血瘀結(jié)于脈絡(luò)導(dǎo)致痹阻不通。艾灸溫通經(jīng)脈、行氣活血的功效與AS的病機高度契合。其起效因素包括熱效應(yīng)、艾煙等，可調(diào)控AS炎性反應(yīng)以延緩AS病理進程［2］。本實驗采用不同處理方式艾燃燒生成物（Moxa combustion products，MCP）干預(yù)動脈粥樣硬化小鼠，進一步挖掘抗AS的相關(guān)作用成分。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用8周齡雄性ApoE-/-小鼠為AS模型，同齡相同遺傳背景雄性非轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠為空白對照，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006?？瞻捉M采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余采用高脂飼料喂養(yǎng)（北京維通利華實驗動物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸），所有小鼠自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和12 h黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循環(huán)。

1.2 試藥與儀器 3年陳艾絨（規(guī)格：20 mm×200 mm）及三年陳艾葉精油（規(guī)格：500 mL/瓶），購自李時珍醫(yī)藥集團有限公司。自制小鼠圓筒網(wǎng)狀固定器（規(guī)格：長90 mm，直徑50 mm）；動式染毒柜（型號：HOPE-MED 8050，天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司）；燃燒爐（自制）；P5L2C光散射式微電腦數(shù)字粉塵測試儀（北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司）；Whatman劍橋濾片F(xiàn)319-04（直徑92 mm），賽譜銳思（北京）科技有限公司生產(chǎn)；魚躍超聲霧化器（型號：402AI，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；干擾素-γ（INF-γ）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，北京瑞格博科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.3 分組方法 40只雄性ApoE-/-小鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組（每組8只）：艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)物組、艾葉精油組、模型組。8只相同遺傳背景同齡的雄性C57BL/6非轉(zhuǎn)基因小鼠作為空白對照。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行干預(yù)。

1.4 干預(yù)方法 1）空白組及模型組：均每日抓取、固定，將小鼠置于無艾煙染毒柜中，每日20 min，每周6 d。2）艾煙組：燃燒爐（與染毒柜相連）中點燃三年陳艾絨1.5 g，艾煙經(jīng)管道導(dǎo)入染毒艙，流量根據(jù)預(yù)設(shè)遮光率全自動調(diào)控；艾煙濃度達(dá)到10 mg/m3～15 mg/m3之間時，染毒柜遮光率為2%左右［3］，20 min約燃燒3年陳艾絨1.5 g。3）濾過艾煙組：染毒艙艾煙入口處安裝Whatman劍橋濾片以截留顆粒物［4］，艾煙生成同上。4）艾絨揮發(fā)物組：將艾絨平鋪于玻璃管內(nèi)，調(diào)設(shè)150℃對環(huán)形加熱器預(yù)熱，待各項參數(shù)穩(wěn)定后，啟動環(huán)形加熱器對玻璃管進行恒溫勻速移動加熱，所用陳艾絨質(zhì)量與艾煙組相等。5）艾葉精油組：取3.75 μL艾葉精油（1.5 g艾絨所含揮發(fā)油含量折合），霧化器中加入16 mL蒸餾水，并連接于染毒艙玻璃入口，霧化速度為0.8 mL/min［5］。干預(yù)組每日抓取、固定，將小鼠置于不同處理方式艾燃燒生成物濃度的染毒柜中，每日20 min，每周6 d。各組每天干預(yù)結(jié)束后，清洗染毒柜。所有組別均干預(yù)觀察14周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h。小鼠麻醉后，眼眶靜脈叢采集血液標(biāo)本約1.5～2 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中，輕輕顛倒混勻，離心15 min（4℃ 3 500 r/min），之后置于-20℃冰箱中備用。采用INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒檢測相應(yīng)指標(biāo)。每組隨機選取6只小鼠，取出主動脈放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色觀察病理變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，若符合正態(tài)分布且方差齊，使用單因素方差分析，再使用LSD進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胸主動脈病理形態(tài) 見圖1。正常組小鼠主動脈管腔大小正常，內(nèi)皮細(xì)胞完整，未見AS斑塊形成。模型組小鼠主動脈管腔明顯狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞破裂，內(nèi)膜及中膜明顯增厚，彈力纖維斷裂，有明顯斑塊形成，斑塊內(nèi)可見較多脂肪滴。艾煙組小鼠主動脈管腔大小正常，少量內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，彈力纖維少量斷裂，較模型組顯著改善。濾過艾煙組小鼠主動脈管腔輕度狹窄，少量內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，少量纖維斑塊形成，較模型組顯著改善。艾絨揮發(fā)組小鼠主動脈管腔輕度狹窄，彈力纖維少量斷裂，少量脂質(zhì)浸潤，較模型組有改善。艾葉精油組小鼠主動脈管腔明顯狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞明顯破壞，中膜增厚，彈力纖維斷裂，粥樣硬化斑塊形成且可見較多脂肪浸潤，與模型組無顯著差異。

圖1 各組小鼠胸主動脈病理（HE染色，20倍）

2.2 各組小鼠血清INF-γ含量比較 見表1。與空白組相比，模型組血清INF-γ含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組血清INF-γ含量均顯著降低（P＜0.05）；艾葉精油組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。各干預(yù)組組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠血清IL-10含量比較 見表1。與空白組相比，模型組血清IL-10含量顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組血清IL-10含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；其余兩組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。不同干預(yù)方式組組間比較：艾煙組血清IL-10含量顯著高于艾絨揮發(fā)組和艾葉精油組（P＜0.05），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比較（±s）

表1 各組小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與艾煙組比較，#P＜0.05。下同。

組別空白組模型組艾煙組濾過艾煙組艾絨揮發(fā)組艾葉精油組n 8 8 8 8 8 8 INF-γ（ng/L）65.88±13.56**100.33±23.07 70.38±22.97*72.31±17.70*74.33±25.85*90.42±31.64 IL-10（ng/L）98.81±14.87**51.26±14.31 95.33±30.36**77.34±14.14*62.48±22.34#69.45±24.68#INF-γ/IL-10（Th1/Th2）0.67±0.10**1.98±0.17 0.73±0.16**0.93±0.11**1.19±0.09#1.37±0.33#

2.4. 各組小鼠INF-γ/IL-10比較 見表1。與空白組相比，模型組INF-γ/IL-10比值顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組INF-γ/IL-10比值均顯著降低（P＜0.01）；其余兩組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。不同干預(yù)方式組組間比較：艾煙組INF-γ/IL-10比值顯著低于艾絨揮發(fā)組和艾葉精油組（P＜0.05），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 各組小鼠血清MMP-9、TIMP-1含量比較 見表2。與空白組相比，模型組小鼠血清MMP-9含量顯著升高（P＞0.05），TIMP-1含量無顯著差異（P＞0.05）。與模型組相比，艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組MMP-9含量顯著降低（P＜0.05），艾葉精油組無顯著差異（P＜0.05），艾煙組TIMP-1含量顯著升高（P＜0.05），其余3組無顯著差異（P＞0.05）。不同干預(yù)方式組組間比較：艾煙組、濾過艾煙組、艾絨揮發(fā)組MMP-9均顯著低于艾葉精油組（P＜0.05），其余組間無顯著差異（P＞0.05）；而艾煙組TIMP-1顯著高于艾絨揮發(fā)組、艾葉精油組（P＜0.01），濾過艾煙組TIMP-1顯著高于艾葉精油組（P＜0.01），其余組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比較（ng/mL，±s）

表2 各組小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比較（ng/mL，±s）

注：與艾葉精油組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾煙組濾過艾煙組艾絨揮發(fā)組艾葉精油組n 8 8 8 8 8 8 MMP-9 22.06±2.36**38.07±9.66 22.20±6.73**△23.21±5.93*△22.40±5.57*△33.81±4.65 TIMP-1 124.28±15.42 130.63±15.10 174.62±15.87*155.60±21.46△137.91±17.04#130.78±20.59#

3 討 論

濾過艾煙組采用劍橋濾片進行濾過艾煙，其顆粒物的截留率高達(dá)97.8%以上［4］，旨在觀察濾過艾煙的成分是否為抗AS的起效因素。艾絨揮發(fā)組采用環(huán)形加熱器加熱艾絨而不使其燃燒，旨在觀察艾煙（有燃燒過程）和艾絨揮發(fā)（無燃燒過程）抗AS療效比較，以探索艾灸燃燒過程對于艾灸的必要性及重要性。艾葉精油組設(shè)置意義在于比較艾燃燒時所產(chǎn)生的揮發(fā)油及其他成分（艾煙）與僅用揮發(fā)油（艾葉精油）在抗AS的療效，探索艾燃燒生成物相關(guān)有效成分抗AS的量效關(guān)系。本實驗創(chuàng)新性設(shè)計出4種不同處理方式艾燃燒生成物干預(yù)AS的方法，以期闡明艾煙起效的相關(guān)性成分。

動脈粥樣硬化斑塊處存在大量的CD4+T細(xì)胞［6］。其中Th1細(xì)胞主要分泌促炎因子INF-γ具有致AS的作用，Th2細(xì)胞主要分泌抑炎性因子IL-10具有抗AS的作用［7］。炎性細(xì)胞在促炎因子作用下，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解纖維帽中膠原纖維，增加斑塊不穩(wěn)定性［8］。本研究選取炎癥免疫反應(yīng)中促炎因子INF-γ、抑炎因子IL-10以及影響斑塊穩(wěn)定性的MMP-9、TIMP-1，以闡明不同處理方式艾燃燒生成物對AS炎癥反應(yīng)及斑塊穩(wěn)定性的作用機制。

INF-γ能激發(fā)炎癥反應(yīng)，并促進MMP產(chǎn)生，最終造成斑塊脫落［9］。此外，IFN-γ通過抑制血管損傷處平滑肌細(xì)胞增殖、收縮及膠原分泌，引起纖維帽變薄造成斑塊不穩(wěn)定［10］。IL-10可減輕血管內(nèi)膜局部的炎癥反應(yīng)，降低炎性因子對平滑肌細(xì)胞的刺激作用［11］。此外，IL-10通過抗凋亡機制抑制泡沫細(xì)胞凋亡，并減少斑塊中MMP的活性以增加斑塊穩(wěn)定性［12］。MMP-9是降解Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠最主要成員之一［13］，加速了動脈粥樣硬化的進程及斑塊的破裂［14］。而血清TIMP-1是MMP-9的內(nèi)源性抑制物，對由MMP-9產(chǎn)生的基質(zhì)降解起重要的平衡作用［15］。TIMP-1能減少斑塊破裂的風(fēng)險，起到穩(wěn)定斑塊的作用［16］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)14周后其血清INF-γ、MMP-9含量升高，IL-10含量降低，說明ApoE-/-小鼠血管內(nèi)存在炎癥反應(yīng)，并提示粥樣斑塊內(nèi)不穩(wěn)定性增加。經(jīng)艾煙及濾過艾煙干預(yù)14周后，ApoE-/-小鼠血清中INF-γ、MMP-9含量顯著降低，IL-10、TIMP-1含量顯著升高，說明艾煙或濾過艾煙可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)，促進MMP-9與TIMP-1之間的動態(tài)平衡以增強斑塊穩(wěn)定性，從而減緩AS的發(fā)展，提示艾煙及濾過艾煙在一定程度上效用相近，說明艾煙中的顆粒物成分可能不是艾灸起效的關(guān)鍵因素，這對于臨床上使用隔煙罩濾過艾煙施灸，即能保證臨床療效，又可減少患者對艾煙顆粒物安全性的疑慮具有指導(dǎo)性價值。而與模型組相比，艾絨揮發(fā)組血清中IL-10、TIMP-1含量無顯著性差異，艾葉精油清中INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量均無顯著性差異，一方面提示艾絨燃燒時氧化或熱解生成的新物質(zhì)可能是艾灸起效的關(guān)鍵成分，另一方面提示艾灸抗AS起效的關(guān)鍵在于艾絨加熱揮發(fā)、熱解、燃燒過程產(chǎn)生的物質(zhì)。艾煙與濾過艾煙在改善AS炎癥及增強斑塊穩(wěn)定性有一定療效，可能與相應(yīng)的炎性通路有關(guān)，進一步研究將在后續(xù)展開。