噬菌體治療細(xì)菌感染的研究進(jìn)展

伍亞云,黃 勛

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)院感染控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

噬菌體在100多年前被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，是特異性感染細(xì)菌的病毒。噬菌體由外層的蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)層的核酸遺傳物質(zhì)組成，無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，個(gè)體十分微小，直徑在100 nm左右[1]。噬菌體感染細(xì)菌具有非常嚴(yán)格的特異性，這種特異性取決于噬菌體以及宿主菌表面受體的分子結(jié)構(gòu)及其互補(bǔ)性[2]。早在噬菌體發(fā)現(xiàn)之初，就被用于治療細(xì)菌感染，但由于當(dāng)時(shí)對(duì)噬菌體的基礎(chǔ)研究還不夠充分，無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化其生產(chǎn)方法，加之噬菌體制劑產(chǎn)物的純度較低等突出問(wèn)題，噬菌體療法在臨床上的應(yīng)用受到相應(yīng)限制。隨后抗生素問(wèn)世，由于其高效、方便、便宜的特點(diǎn)，很快在世界各地應(yīng)用廣泛，至今仍是臨床上抗感染治療的最主要方法，而關(guān)于噬菌體的研究也逐漸放緩。近二十余年來(lái)，細(xì)菌耐藥問(wèn)題逐漸突出，多重耐藥菌不斷出現(xiàn)，尋找細(xì)菌耐藥問(wèn)題的解決方法是目前抗感染治療的重點(diǎn)及趨勢(shì)，因此，曾經(jīng)快被人們淡忘的噬菌體療法又再次受到研究人員的重視。本研究基于國(guó)內(nèi)外噬菌體的研究現(xiàn)狀，對(duì)噬菌體療法的發(fā)展、應(yīng)用、特點(diǎn)作一綜述，綜合歸納噬菌體在細(xì)菌感染治療方面的應(yīng)用，并分析噬菌體療法的優(yōu)勢(shì)和局限性。

1 噬菌體的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展

噬菌體的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。1915年英國(guó)的Frederick Twort首次觀察到了噬菌體，1917年一個(gè)法裔加拿大微生物學(xué)家Felixd’herelle分離并命名噬菌體[1]。1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)了青霉素，緊接著人們又發(fā)現(xiàn)，與噬菌體的特異性感染相比，青霉素等其他抗生素抗菌譜更廣[3]。由于當(dāng)時(shí)關(guān)于噬菌體療法的不確定性以及抗生素的強(qiáng)大抗菌效果，最終導(dǎo)致人們對(duì)噬菌體的研究興趣逐漸下降，只有前蘇聯(lián)和其他部分東歐國(guó)家仍在繼續(xù)研究噬菌體療法。近二十余年來(lái)，細(xì)菌耐藥問(wèn)題逐漸突出，給臨床感染性疾病治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。如何克服細(xì)菌耐藥問(wèn)題是目前抗感染治療，尤其是多重耐藥菌感染的研究重點(diǎn)。針對(duì)耐藥問(wèn)題，有科學(xué)家提出研發(fā)新型抗菌藥物，尋找新的細(xì)菌靶點(diǎn)，找到并破壞細(xì)菌的耐藥基因等方法，但這些新方法研發(fā)成本大，研究周期長(zhǎng)，無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)有效解決目前日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題。在此背景下，曾經(jīng)逐漸淡出人們視線(xiàn)的噬菌體療法又重新受到重視。

2 噬菌體的分類(lèi)

根據(jù)是否能裂解細(xì)菌，噬菌體分為烈性噬菌體(溶菌型噬菌體)和溫和噬菌體(溶原型噬菌體)兩大類(lèi)。烈性噬菌體裂解宿主菌的主要步驟可概括為：吸附、侵入、復(fù)制、裝配成熟、裂解。噬菌體吸附在宿主菌細(xì)胞表面以后，噬菌體尾部結(jié)構(gòu)的酶可以穿透宿主菌的肽聚糖層，隨后穿透內(nèi)膜釋放核酸到細(xì)菌內(nèi)部。噬菌體尾部蛋白還可以抑制已注入到宿主菌內(nèi)部的噬菌體核酸物質(zhì)被細(xì)菌排出，當(dāng)噬菌體的核酸與宿主菌核酸整合完畢后，與細(xì)菌核酸一起復(fù)制，并可以與表達(dá)的蛋白質(zhì)外殼重新組裝成新的子代噬菌體，擁有溶菌能力。在細(xì)胞溶解酶和/或穿孔蛋白的作用下，最終裂解感染的細(xì)菌，裂解后釋放出的子代噬菌體還可以通過(guò)一樣的方式繼續(xù)侵染裂解周?chē)乃拗骶鶾4]。因烈性噬菌體能夠在侵入宿主菌后不斷增殖并裂解細(xì)菌，導(dǎo)致宿主菌死亡，因此一般都用烈性噬菌體治療細(xì)菌感染。

溫和噬菌體將DNA或RNA整合到宿主菌的核酸后，噬菌體的核酸隨著宿主菌的復(fù)制而不斷復(fù)制，并隨著宿主菌的分裂不斷進(jìn)入下一代宿主菌細(xì)胞內(nèi)，一般不會(huì)引起宿主菌的裂解。此為溫和噬菌體的溶原期，這種與細(xì)胞宿主同時(shí)進(jìn)行增殖但又不使其裂解的現(xiàn)象稱(chēng)為溶原現(xiàn)象。但在某些外部誘因條件下，整合到宿主菌核酸上的噬菌體DNA或RNA又可以從宿主菌基因組中自發(fā)脫離出來(lái)，進(jìn)入溶菌周期，組裝成完整的子代噬菌體，最終可以裂解宿主菌。

3 噬菌體治療不同部位的細(xì)菌感染

3.1 皮膚和軟組織感染 目前，利用噬菌體治療皮膚軟組織感染已經(jīng)在不同的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的研究和測(cè)試。最常見(jiàn)的是小鼠創(chuàng)傷模型，具體包括燒傷模型、腫瘤手術(shù)創(chuàng)傷模型和足部感染模型等。大部分針對(duì)皮膚軟組織感染的噬菌體治療研究使用的是混合噬菌體，而不是單一噬菌體。Chadha等[5]在小鼠燒傷感染模型中比較單一噬菌體和噬菌體雞尾酒(多種噬菌體混合制劑)療法的效果，結(jié)果證實(shí)雖然單一噬菌體療法能夠使細(xì)菌數(shù)量減少，但噬菌體雞尾酒療法效果更優(yōu)。在小鼠燒傷創(chuàng)面模型中發(fā)現(xiàn)，將噬菌體應(yīng)用于局部時(shí)，噬菌體產(chǎn)生的保護(hù)水平高于抗生素提供的保護(hù)水平[6]。噬菌體制劑的給藥途徑已被證明對(duì)傷口感染治療的效果有重要影響。Mcvay等[7]將三種噬菌體混合在一起，通過(guò)三種不同的途徑一次性給藥：肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射和皮下注射，結(jié)果顯示，雖然噬菌體制劑經(jīng)由三種給藥途徑均能提高小鼠存活率，但腹腔內(nèi)注射效果最好，這種差異可能是噬菌體經(jīng)不同給藥途徑后產(chǎn)生的不同藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果所致。Yin等[8]通過(guò)建立小鼠局部創(chuàng)傷感染模型，比較噬菌體的局部應(yīng)用和皮下注射的療效，結(jié)果證實(shí)局部使用噬菌體制劑的小鼠創(chuàng)面愈合更好，提示局部應(yīng)用噬菌體是治療局部創(chuàng)傷感染的更好選擇。

3.2 呼吸道感染 許多研究者用小鼠和水貂動(dòng)物模型進(jìn)行噬菌體治療呼吸道細(xì)菌感染。在Cao等[9]試驗(yàn)中，將多重耐藥肺炎克雷伯菌接種到小鼠肺部，在接種后2 h，通過(guò)經(jīng)鼻吸入肺炎克雷伯菌噬菌體可保護(hù)小鼠不患致命性肺炎。該研究團(tuán)隊(duì)還用噬菌體治療肺部感染的水貂，結(jié)果顯示給予噬菌體治療12 d后水貂存活率為80%。肺部感染銅綠假單胞菌的小鼠經(jīng)鼻吸入噬菌體制劑，可以有效地殺滅銅綠假單胞菌，用噬菌體治療6 h后可將細(xì)菌負(fù)荷降低到不可檢測(cè)的水平；而未經(jīng)噬菌體制劑處理的小鼠，其肺部的銅綠假單胞菌細(xì)胞大量增殖[10]。Debarbieux研究團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了在小鼠肺部感染銅綠假單胞菌2 h后,使用經(jīng)鼻吸入噬菌體制劑可以挽救95%的小鼠[11]。Oduor等[12]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射噬菌體制劑可以治療金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠肺炎，以108PFU/mL的滴度給噬菌體，可以將細(xì)菌載量從8 CFU/g降低到0.5 CFU/g。為了解噬菌體治療長(zhǎng)期慢性肺部感染的效果，一項(xiàng)研究在小鼠肺部感染銅綠假單胞菌6 d后，通過(guò)經(jīng)鼻吸入噬菌體，能有效減少小鼠肺部的細(xì)菌數(shù)量[13]，提示噬菌體療法在治療慢性呼吸道感染方面具有潛力。

3.3 胃腸道感染 胃腸道感染的常見(jiàn)致病菌有大腸埃希菌、空腸彎曲桿菌、腸沙門(mén)菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等，一些不常見(jiàn)的致病菌如艱難梭菌和霍亂弧菌也可以引起腸胃炎。在兔感染霍亂弧菌后的6 h和12 h予以混合噬菌體治療，結(jié)果證實(shí)兩組都可以減少霍亂弧菌的數(shù)量[14]。倉(cāng)鼠模型證實(shí)，混合噬菌體可顯著減少艱難梭菌感染36 h后的定植，并將疾病癥狀的開(kāi)始時(shí)間延遲33 h[15]。Galtier等[16]證實(shí)噬菌體可以有效減少腸道病原體，且與抗生素相比，噬菌體對(duì)腸道微生物群組成的影響也更小。另外，研究表明噬菌體療法的效果和使用噬菌體的時(shí)間有關(guān)。試驗(yàn)表明，在兔感染霍亂弧菌之后的6 h和12 h分別口服噬菌體制劑，都能減少霍亂弧菌的載量；但在霍亂弧菌感染之前的6 h和12 h分別口服噬菌體制劑，都不能使霍亂弧菌載量減少[14]。該試驗(yàn)表明，在感染霍亂弧菌后數(shù)小時(shí)內(nèi)口服噬菌體能夠減少病原體，但提前使用噬菌體不能起到預(yù)防性抗感染效果。

3.4 泌尿道感染 泌尿道感染多由腸桿菌目細(xì)菌引起。研究者先向小鼠膀胱中注射致死劑量的致病性大腸埃希菌，再立即向小鼠腹腔中注入噬菌體，之后觀察到噬菌體被注入腹腔后還可以分泌到尿液中；還發(fā)現(xiàn)噬菌體治療泌尿道感染的效果與噬菌體種類(lèi)和劑量有關(guān)：在MOI=60的情況下，T4噬菌體抗感染效果最好，可以使小鼠100%存活[17]。長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管的患者容易發(fā)生泌尿道感染，有文獻(xiàn)報(bào)道在留置的導(dǎo)尿管上涂抹針對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和奇異變形桿菌的噬菌體后，導(dǎo)尿管上細(xì)菌生物膜的形成可顯著減少[18]。一例難治性銅綠假單胞菌泌尿道感染的患者，通過(guò)抗生素聯(lián)合噬菌體輔助治療后最終連續(xù)6個(gè)月尿培養(yǎng)為陰性[19]。

3.5 菌血癥 菌血癥常導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)的快速死亡，因此通常在細(xì)菌感染后不久立即應(yīng)用噬菌體治療。Schneider等[20]給小鼠注射致死劑量的大腸埃希菌導(dǎo)致菌血癥，分別在注射細(xì)菌后的10 min和60 min注射同等劑量噬菌體，觀察到小鼠存活率分別為100%、95%，在細(xì)菌感染后3 h注射噬菌體則沒(méi)有小鼠存活。另一項(xiàng)研究表明，在大腸埃希菌導(dǎo)致的大鼠菌血癥模型中，分別在注射細(xì)菌后7 h和24 h給予噬菌體，大鼠存活率分別為100%和50%[21]。除了小鼠模型外，也有研究者采用果蠅模型評(píng)估噬菌體治療菌血癥的療效。通過(guò)給黑腹果蠅注射致死劑量的銅綠假單胞菌建立菌血癥模型，再給其喂食噬菌體，結(jié)果顯示能夠顯著延緩或防止果蠅死亡。研究表明，與單一噬菌體治療相比，注射三種肺炎鏈球菌噬菌體雞尾酒制劑具有更強(qiáng)的治療效果[22]。關(guān)于給藥方式，Oliveira等[23]研究表明，噬菌體治療菌血癥最合適的途徑是靜脈注射。

3.6 其他特殊部位感染

3.6.1 腹腔感染 腹腔感染(intra-abdominal infection，IAI)包括腹腔內(nèi)單個(gè)臟器感染、腹腔膿腫以及腹膜炎，根據(jù)其感染范圍及嚴(yán)重程度可分為單純性腹腔感染和復(fù)雜性腹腔感染。腹腔感染若不能有效控制，還可以引起膿毒血癥、感染性休克、多器官功能衰竭[24]。將致死劑量的金黃色葡萄球菌注射到小鼠單側(cè)腹腔內(nèi)，試驗(yàn)組分別在感染后0、1、2 h將噬菌體制劑注射到另一側(cè)腹腔內(nèi)，對(duì)照組將SM緩沖液注射到另一側(cè)腹腔內(nèi)，結(jié)果顯示感染后0、1、2 h，用噬菌體處理的小鼠7 d后存活率分別為80%、80%、50%；用SM緩沖液處理的對(duì)照組7 d后存活率為0；同時(shí)，給未感染金黃色葡萄球菌的小鼠腹腔內(nèi)注射噬菌體，7 d后存活率為100%，表明噬菌體治療可以抵抗金黃色葡萄球菌腹腔感染，提高小鼠存活率，且噬菌體療法是安全的[25]。

3.6.2 眼部感染 研究人員用含有銅綠假單胞菌噬菌體的滴眼液外用于正常小鼠的角膜，結(jié)果顯示不會(huì)引起角膜混濁或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)。隨后選擇銅綠假單胞菌性角膜炎小鼠模型，在角膜感染后30 min用含噬菌體的滴眼液滴眼，結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠5 d后角膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，而未經(jīng)噬菌體處理的對(duì)照組小鼠5 d后角膜大部分已穿孔[26]。在小鼠角膜感染銅綠假單胞菌30 min以及1、3、6、12 h后，用含有兩種噬菌體的滴眼液滴眼，結(jié)果顯示，在角膜感染30 min后給予噬菌體滴眼液可預(yù)防角膜炎；在角膜感染后3 h內(nèi)給予噬菌體滴眼液，小鼠角膜細(xì)菌計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明具有抗菌作用[27]。

3.6.3 耳部感染 將含有6種不同噬菌體的雞尾酒制劑注入患有慢性銅綠假單胞菌性中耳炎的狗耳道中，在治療48 h后臨床評(píng)分和細(xì)菌計(jì)數(shù)均下降，且未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[28]。一項(xiàng)評(píng)價(jià)噬菌體制劑治療慢性中耳炎的臨床試驗(yàn)，研究者將24例持續(xù)數(shù)年的耐藥銅綠假單胞菌慢性中耳炎患者隨機(jī)分為2組，分別用噬菌體和安慰劑進(jìn)行治療，結(jié)果顯示噬菌體治療組患者銅綠假單胞菌數(shù)量明顯減少，且未發(fā)現(xiàn)局部或全身副作用，而安慰劑組患者細(xì)菌計(jì)數(shù)則沒(méi)有明顯變化[29]。

3.6.4 口腔感染 一項(xiàng)研究用腸球菌噬菌體制劑治療大鼠根管感染，將噬菌體制劑注射到大鼠根管中，凝膠化過(guò)程中噬菌體在根管內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散，經(jīng)過(guò)持續(xù)3周的治療后，腸球菌細(xì)菌計(jì)數(shù)減少99%[30]。

4 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)和局限性

4.1 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì) 噬菌體在自然界中分布廣泛，分離途徑比較簡(jiǎn)單，且周期短，一般只需要數(shù)周左右。與抗菌藥物研發(fā)周期動(dòng)輒數(shù)年甚至數(shù)十年相比，噬菌體具有研發(fā)周期短、投入成本低的優(yōu)點(diǎn)。由于抗菌藥物具有廣譜抗菌能力，除了致病菌外還可以殺滅體內(nèi)其他非致病菌，因此長(zhǎng)期使用抗菌藥物會(huì)引起體內(nèi)菌群失調(diào)，還可能引發(fā)機(jī)會(huì)感染。噬菌體是特異性感染宿主菌，一種噬菌體只能侵染特定病原菌，因此不會(huì)影響機(jī)體其他正常菌群。目前，已有大量研究表明噬菌體治療不會(huì)產(chǎn)生明顯副作用，噬菌體療法的安全性得到了初步認(rèn)可?？咕幬飳?duì)細(xì)菌生物膜的治療效果有限，但噬菌體可以通過(guò)分泌細(xì)胞壁水解酶、胞外多糖解聚酶等破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)，從而治療細(xì)菌生物膜感染[31-32]。長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用抗菌藥物，細(xì)菌容易產(chǎn)生抗性，有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的突變頻率為10-5。雖然細(xì)菌對(duì)噬菌體也可以產(chǎn)生抗性，但噬菌體可以和細(xì)菌共同進(jìn)化以此來(lái)對(duì)抗其產(chǎn)生的抗性，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的突變頻率為10-7[2,33]。因此，面對(duì)目前抗菌藥物耐藥問(wèn)題逐漸嚴(yán)重的形勢(shì)，噬菌體可以提供一個(gè)新的治療方向。

4.2 噬菌體治療的局限性 細(xì)菌被噬菌體裂解后可以釋放內(nèi)毒素，且噬菌體表面的蛋白質(zhì)成分也可以作為抗原引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響噬菌體的復(fù)制，甚至導(dǎo)致噬菌體的滅活，最終降低其裂解細(xì)菌的能力。噬菌體侵染細(xì)菌具有高度特異性，抗菌譜也很窄，因此通常需要使用含多種噬菌體的雞尾酒制劑來(lái)擴(kuò)大抗菌范圍，這也使生產(chǎn)難度和成本相應(yīng)增加[34]。部分噬菌體攜帶有毒力基因，當(dāng)噬菌體進(jìn)入宿主菌后，毒力基因可以在裂解細(xì)菌的過(guò)程中不斷表達(dá)，從而產(chǎn)生毒力因子，對(duì)人體產(chǎn)生不利影響[35]。雖然目前已有較多針對(duì)噬菌體療法的動(dòng)物試驗(yàn)，但用于人體的臨床試驗(yàn)仍相對(duì)不足，在除俄羅斯和波蘭等東歐國(guó)家以外的大部分地區(qū)，噬菌體還缺乏有效的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有獲得政府部門(mén)的授權(quán)許可。因此，在未來(lái)，噬菌體療法仍有許多挑戰(zhàn)和難題需要解決。

5 總結(jié)

日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題使得既往被忽視的噬菌體重回廣大研究者視線(xiàn)，近年來(lái)關(guān)于噬菌體的研究也逐漸增多。目前，已有噬菌體治療各部位細(xì)菌感染(如皮膚軟組織、呼吸道、胃腸道、泌尿系統(tǒng)等)的相關(guān)研究，但這些研究大多都是動(dòng)物試驗(yàn)，如小鼠、兔、水貂模型等，用于人體的臨床試驗(yàn)研究仍很少。雖然大部分在動(dòng)物模型中進(jìn)行的噬菌體治療研究顯示出有效性和安全性，但不能完全代表在人類(lèi)身上也一定能取得同樣效果。因此，未來(lái)可以在確保噬菌體療法足夠安全和有效的前提下，逐漸開(kāi)展臨床試驗(yàn)。此外，噬菌體還有攜帶毒力基因、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、抗菌譜窄等局限性，這些問(wèn)題也亟待解決。雖然噬菌體為目前細(xì)菌耐藥局面提供了一個(gè)有前景的發(fā)展方向，但要正式應(yīng)用于臨床還有許多難題和挑戰(zhàn)需要克服。希望在已有的國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上，未來(lái)可以早日突破目前的研究難點(diǎn)，解決耐藥細(xì)菌感染問(wèn)題。